Les changements dans les interactions sur des échelles de temps écologiques influencent

Jan 26, 2024

The ISME Journal volume 17, pages 406–416 (2023)Citer cet article

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Les communautés microbiennes prospèrent dans presque tous les habitats de la planète. Au sein de ces communautés, les cellules interagissent par la libération et l'absorption de métabolites. Ces interactions peuvent avoir des effets synergiques ou antagonistes sur les membres individuels de la communauté. L'activité métabolique collective des communautés microbiennes entraîne des modifications de leur environnement local. Comme l'environnement change avec le temps, la nature des interactions entre les cellules peut changer. Nous ne comprenons pas actuellement comment ces rétroactions dynamiques affectent la dynamique de croissance des microbes individuels et de la communauté dans son ensemble. Ici, nous étudions comment les interactions médiées par l'échange de métabolites à travers l'environnement changent au fil du temps au sein d'une simple communauté microbienne marine. Nous avons utilisé une approche basée sur la microfluidique qui nous permet de démêler l'effet des cellules sur leur environnement de la façon dont elles réagissent à leur environnement. Nous avons constaté que les interactions entre deux espèces - un dégradeur de chitine et un alimentateur croisé qui consomme des sous-produits métaboliques - changent dynamiquement au fil du temps à mesure que les cellules modifient leur environnement. Les cellules interagissent initialement positivement, puis commencent à entrer en compétition à des stades ultérieurs de croissance. Nos résultats démontrent que les interactions entre les micro-organismes ne sont pas statiques et dépendent de l'état de l'environnement, soulignant l'importance de démêler comment les modifications de l'environnement affectent les interactions entre les espèces. Cette approche expérimentale peut apporter un nouvel éclairage sur la façon dont les interactions interspécifiques évoluent jusqu'aux processus au niveau communautaire dans les environnements naturels.

Les micro-organismes contribuent au cycle global des éléments, à la santé de l'hôte et à de nombreux processus industriels. Pourtant, nous manquons actuellement de connaissances quantitatives sur les mécanismes exacts de la façon dont les interactions interspécifiques modulent la croissance des membres individuels de la communauté, et comment la croissance des membres individuels de la communauté s'intensifie pour déterminer l'activité et la croissance de la communauté [1]. Un tel aperçu nous permettrait de mieux comprendre comment les activités observées au niveau des communautés microbiennes émergent des processus à des niveaux inférieurs d'organisation.

Les espèces des consortiums microbiens remplissent collectivement des fonctions métaboliques : les processus cataboliques sont souvent répartis entre différentes espèces qui interagissent par l'échange de métabolites intermédiaires dans l'environnement [2]. Ce métabolisme distribué est surtout fréquent pour les substrats complexes dont la dégradation implique plusieurs réactions enzymatiques [3]. Dans les environnements naturels, une ressource majeure pour les communautés microbiennes sont les polymères naturels, tels que la cellulose et la chitine [4]. Ces polymères sont des composants structuraux d'organismes multicellulaires (cellulose chez les plantes et chitine chez les arthropodes), et sont libérés dans l'environnement lors de la mort de ces organismes. Une communauté complexe d'espèces en interaction est généralement formée sur ces polymères [5]. Des bactéries spécialisées clivent les polymères via des enzymes extracellulaires en sous-unités accessibles, c'est-à-dire des mono ou oligomères de sucre suffisamment petits pour être importés dans la cellule [6]. Ce processus jette les bases d'une cascade trophique qui conduit à la reminéralisation éventuelle des polymères naturels. Certaines cellules bactériennes n'ayant pas la capacité de dégrader les polymères sont capables d'absorber les produits de dégradation du milieu environnant [7]. Ces soi-disant consommateurs bénéficient ainsi directement de la présence de dégradants. D'autres espèces microbiennes dépourvues des enzymes nécessaires à la dégradation du polymère sont en outre incapables de cataboliser les produits de dégradation clivés ; ils dépendent des sous-produits métaboliques excrétés comme substrats de croissance [8]. Ce processus s'appelle l'alimentation croisée.

L'alimentation croisée, ou syntrophie, est une interaction dans laquelle un organisme utilise les sous-produits d'un autre organisme comme ressource [9, 10]. On pense généralement que l'alimentation croisée sous-tend de nombreuses relations mutualistes entre les microbes, fournissant une force motrice pour le maintien de la diversité dans les communautés microbiennes [11,12,13]. L'alimentation croisée peut également être bénéfique pour l'espèce qui excrète les sous-produits [14]. Premièrement, l'élimination du produit des réactions biochimiques augmente la vitesse de réaction selon le "principe de Le Chatelier" [15]. Deuxièmement, l'alimentation croisée peut permettre l'élimination des sous-produits métaboliques toxiques qui inhibent la croissance de leurs producteurs [16, 17].

Les interactions entre les espèces sont généralement classées comme positives, négatives ou neutres et sont généralement quantifiées en mesurant la différence de rendement ou de taux de croissance en co-vs. monocultures [18]. Cette approche suppose que les interactions au sein des communautés restent constantes pendant la période de temps sur laquelle elles sont mesurées. Cependant, en consommant et en libérant des nutriments, les cellules modifient dynamiquement leur environnement. À leur tour, les individus modifient leur comportement métabolique pour s'adapter aux changements qu'ils provoquent dans leur environnement [19]. Ce processus peut entraîner une modification des interactions métaboliques entre les espèces avec le temps.

Les cellules réagissent aux changements de l'environnement qui sont causés à la fois par leur propre activité et par l'activité de tous les autres membres de la communauté. Cela conduit à une boucle de rétroaction complexe où l'état de l'environnement, l'activité métabolique des membres de la communauté et les interactions entre tous ces membres deviennent interdépendants [9]. Afin d'acquérir une compréhension mécaniste de la dynamique communautaire complexe, il est essentiel de démêler la façon dont les cellules réagissent à leur environnement (c.-à-d. les métabolites que les autres membres de la communauté libèrent) de l'effet que ces cellules ont elles-mêmes sur leur environnement (c. Cependant, cela ne peut pas être fait facilement en utilisant des techniques de culture traditionnelles.

Ici, nous avons développé une nouvelle approche basée sur la microfluidique qui nous permet d'analyser comment les changements dans l'environnement, causés par l'activité métabolique collective d'une communauté, affectent la dynamique de croissance des cellules individuelles. La microfluidique nous permet de découpler la réponse d'une cellule à son environnement de l'effet qu'elle a sur l'environnement lui-même. Cette approche permet ainsi de quantifier l'évolution dans le temps des interactions métaboliques entre espèces.

Nous appliquons notre méthode pour étudier les interactions dans une communauté d'origine naturelle qui utilise la chitine polymère. Cette communauté est constituée d'un dégradeur et d'une espèce métisse : Vibrio natriegens et Alteromonas macleodii. Vibrio natriegens est un dégradeur de la chitine marine [20]. Il sécrète des enzymes chitinolytiques dans l'environnement afin de cliver les oligomères de chitine en monomères et dimères qu'il peut absorber dans la cellule. Alteromonas macleodii est incapable de dégrader la chitine [5]. De plus, il n'a pas la capacité de consommer les produits de dégradation de la chitine. En tant qu'espèce à alimentation croisée, elle dépend des sous-produits métaboliques excrétés produits par le dégradeur.

Nous constatons que l'interaction entre le dégradeur et l'alimentateur croisé change au fil du temps, passant du mutualisme à la concurrence pour les sous-produits métaboliques excrétés. De plus, l'interaction initialement positive entre le dégradeur et l'alimenteur croisé conduit à une activité enzymatique accrue au niveau de la communauté par rapport à une situation où le dégradeur se développe seul. Enfin, nous avons constaté que les taux de croissance des cellules individuelles peuvent présenter des variations substantielles, en particulier pour les mangeurs croisés pendant les périodes de faibles concentrations en nutriments.

Nous avons développé une nouvelle approche basée sur la microfluidique qui nous permet d'étudier la dynamique de croissance de cellules individuelles qui connaissent un environnement qui change dynamiquement en réponse au métabolisme collectif d'une communauté microbienne. Pour ce faire, nous couplons un dispositif de machine mère [21] à une culture par lots communautaire et suivons la croissance cellulaire à l'aide d'une microscopie accélérée (Fig. 1B). Le dispositif microfluidique contient les deux membres d'une communauté simple composée de Vibrio natriegens - le dégradeur - et d'Alteromonas macleodii - le transducteur (Fig. 1A). Le dispositif est relié à une culture discontinue d'alimentation dans un flacon de sérum. Nous inoculons des bactéries (soit le dégradeur seul, soit le dégradeur et le chargeur croisé) à faible densité dans ces flacons de sérum contenant un milieu de croissance stérile et un polymère de chitine comme source de carbone (Fig. 1C, D). Au fur et à mesure que les cellules microbiennes dans la culture discontinue d'alimentation consomment des ressources et se développent, elles passent d'une phase de croissance retardée à exponentielle à stationnaire. Au cours de ce processus, ils modifient séquentiellement leur environnement de deux manières principales : les nutriments initialement disponibles sont consommés par les membres de la communauté, tandis que de nouveaux nutriments, tels que les sous-produits métaboliques, deviennent disponibles via la libération de métabolites dans l'environnement. L'absorption et la libération de métabolites modifient constamment l'environnement biochimique au sein de la culture discontinue et par conséquent dans le dispositif microfluidique attaché. Les cellules du dispositif microfluidique sont ainsi exposées au même environnement métabolique, qui change dans le temps, que la communauté dans la culture par lots, mais comme elles sont situées en aval, elles ne peuvent pas modifier l'environnement. Cette approche nous permet ainsi de démêler comment les interactions métaboliques au sein des communautés microbiennes évoluent dans le temps. Des études antérieures ont utilisé des approches similaires afin de répondre à des questions fondamentales sur la physiologie microbienne dans les populations clonales [22,23,24,25]. Ici, nous utilisons cette approche pour étudier la dynamique de croissance des cellules individuelles dans des communautés microbiennes simples.

Une illustration schématique des interactions métaboliques entre le dégradeur (V. natriegens, jaune) et le cross-feeder (A. macleodii, vert) dans une situation où la chitine est la seule source de carbone disponible. B Configuration microfluidique pour quantifier la dynamique de croissance des cellules individuelles qui connaissent un environnement de culture par lots. Les bactéries sont cultivées dans un dispositif microfluidique et sont surveillées à l'aide d'une microscopie accélérée. L'appareil est connecté à une culture discontinue contenant des nutriments et des bactéries. Via une pompe péristaltique, une petite proportion de la culture d'alimentation est constamment évacuée à travers la puce microfluidique. Les cellules individuelles dans le dispositif microfluidique connaissent le même environnement que les cellules de la culture discontinue d'alimentation. Par la consommation de nutriments et l'excrétion de sous-produits métaboliques, les cellules de la culture discontinue modifient l'environnement. Les cellules dans le dispositif microfluidique répondront au changement d'environnement, c'est-à-dire via des changements de taux de croissance, mais ne peuvent pas changer elles-mêmes l'environnement. C, D Les puces microfluidiques sont constituées de plusieurs canaux principaux indépendants. Chaque canal est chargé avec l'une des deux espèces qui constituent la communauté et connecté à une seule culture par lots qui contient soit la communauté complète avec les deux espèces (C) ou uniquement les espèces dégradantes (D). En comparant les propriétés unicellulaires de diverses combinaisons batch-microfluidique, nous pouvons étudier comment la présence d'espèces dans les communautés affecte les autres et elles-mêmes. Les images ont été ajustées à partir de BioRender et partiellement fournies par Daniel J. Kiviet.

Nous avons d'abord étudié la dynamique de croissance dans l'environnement métabolique créé par l'ensemble de la communauté d'alimentation croisée composée à la fois du dégradeur et du consommateur. Nous avons inoculé la culture discontinue avec les deux espèces et suivi la croissance sur un cycle complet (c'est-à-dire du décalage, via exponentielle, à la phase stationnaire). Dans la culture discontinue d'alimentation, le dégradeur libère des enzymes lytiques dans l'environnement et consomme les oligomères de chitine. Au cours de ce processus, le dégradeur libère des sous-produits métaboliques dans l'environnement qui sont à leur tour consommés par l'alimentateur croisé. Nous avons analysé la dynamique de croissance des espèces individuelles en mesurant les taux de croissance des cellules individuelles dans le dispositif microfluidique. L'alimentateur croisé et le dégradeur commencent à se développer presque instantanément après l'inoculation de la culture par lots (Fig. 2). Cela indique que les nutriments pour l'alimentation croisée sont libérés dès que les dégradeurs commencent à dégrader la chitine. Au fur et à mesure que les cellules se développent et que les nutriments s'épuisent, les deux espèces passent à la phase stationnaire où leurs taux de croissance approchent de zéro. Pour le dégradeur, la croissance s'arrête vers 25 h tandis que pour le cross-feeder, la croissance se poursuit jusqu'à 40 h (Fig. 2). La différence de durée de la phase de croissance peut s'expliquer par des différences de niches métaboliques. Alors que le dégradeur se développe principalement sur les produits de dégradation de la chitine [26], l'alimentateur croisé peut utiliser au moins un sous-produit métabolique excrété par le dégradeur [27].

Les cellules de dégradeur (jaune) et d'alimentation croisée (vert) dans des dispositifs microfluidiques ont été connectées à une culture discontinue en croissance contenant une co-culture du dégradeur et de l'alimentation croisée. Dans la culture discontinue, les cellules se développaient dans un milieu minimal contenant 0,1 % (p/v) de chitopentaose. Les taux de croissance unicellulaire (points) de chaque cellule présente ont été tracés en fonction du temps. Les lignes représentent les moyennes lissées (geom_smooth, ggplot2, RStudio) à chaque intervalle de temps en utilisant un modèle additif généralisé. Au fur et à mesure que la chitine est dégradée via des enzymes sécrétées, des ressources deviennent disponibles et les deux types de cellules commencent à se développer. Les cross-feeders croissent plus longtemps avant que les taux de croissance ne tombent à zéro. Quatre expériences répétées ont été réalisées. Au total, 5608 cellules individuelles ont été analysées (N(Degrader) = 1707 ; N(Cross-feeder) = 3901). Cela conduit à 270 677 taux de croissance monocellulaire instantanés (N(Degrader) = 140 126 ; N(Cross-feeder) = 130 551). 1363 (N(Degrader) = 1086; N(Cross-feeder) = 274) points de données ne sont pas affichés car ils se situent hors de la plage de l'axe.

Nous avons observé que les taux de croissance évoluaient de manière non monotone dans le temps (Fig. 2) ; cela soulève la question de savoir si les interactions métaboliques entre les dégradeurs et les aliments croisés changent avec le temps et comment cela affecte la croissance du dégradeur. Pour répondre à cette question, nous avons mesuré la dynamique de croissance unicellulaire des cellules dégradatrices dans deux environnements différents. Plus précisément, nous avons alimenté des cellules dégradatrices avec deux cultures par lots différentes ; une culture contenait une co-culture de dégradeur et d'alimentateur croisé (Fig. 2) tandis que la seconde culture contenait le dégradeur en mono-culture.

Nous avons constaté que la dynamique de croissance du dégradeur dans ces deux conditions différait de deux façons principales (Fig. 3A) : initialement, le taux de croissance du dégradeur était plus élevé en présence du cross-feeder. En présence du cross-feeder, le dégradeur a montré une augmentation de 11% du taux de croissance au cours des 20 premières heures. Cela indique que l'alimentation croisée facilite la croissance du dégradeur dans les premiers stades de leur interaction métabolique (Fig. 3A, C). Aux stades ultérieurs, les cellules dégradatrices en monoculture présentent une phase de croissance secondaire claire (Fig. 3A). Cette phase de croissance manque dans l'environnement de co-culture. Les cellules dégradatrices dans l'environnement de mono-culture se développent à des taux plus élevés dans cette phase de croissance secondaire que les individus qui connaissent un environnement de co-culture. En l'absence de l'alimentateur croisé, le dégradeur avait un taux de croissance supérieur d'environ 173 % au cours de la phase de croissance secondaire. La croissance pendant la phase de croissance secondaire conduit à une accumulation globale de biomasse plus élevée dans les cellules dégradatrices qui ont connu un environnement de monoculture sans alimentateurs croisés à la fin de l'expérience de 40 h (Fig. 3B, D). La phase de croissance secondaire peut s'expliquer par la recapture de sous-produits métaboliques précédemment excrétés et correspond au déplacement diauxique observé dans divers systèmes microbiologiques [28, 29].

Les cellules dégradatrices dans des puces microfluidiques ont été connectées à deux cultures discontinues différentes : une avec des cellules dégradatrices en monoculture (rouge) et une avec une co-culture de dégradeur et le cross-feeder (jaune). A Les taux de croissance unicellulaire (points) sont tracés en fonction du temps. Les lignes représentent les moyennes lissées (geom_smooth, ggplot2, RStudio) à l'aide d'un modèle additif généralisé. Au cours des premières heures, les cellules dégradantes alimentées par des milieux de co-culture se développent plus rapidement que les cellules connaissant un environnement de mono-culture. À des moments ultérieurs, nous observons une phase de croissance secondaire marquée pour les cellules alimentées par mono-culture qui est absente pour les cellules alimentées par co-culture. Quatre expériences répétées ont été réalisées. Au total, 99 canaux de machine mère ont été analysés (N (co-culture) = 49 ; N (monoculture) = 51). Au total, 3934 cellules individuelles ont été analysées (N(Mono-culture) = 2227 ; N(Co-culture) = 1707). 1494 (N(Mono-culture) = 405 ; N(Co-culture) = 1089) points de données ne sont pas affichés car ils se situent hors de la plage de l'axe. B Accumulation de biomasse de cellules dégradatrices dans un environnement de mono ou de co-culture. Les cellules qui connaissent un environnement de co-culture (jaune) ont tendance à croître à des rendements plus élevés dans les 20 premières heures que les cellules qui connaissent un environnement de mono-culture (rouge). En raison des avantages de la phase de croissance secondaire, les cellules en monoculture semblent atteindre des rendements globaux plus élevés à la fin de l'expérience. C Comparaison du taux de croissance moyen des cellules dégradatrices entre les deux principales phases de croissance. Les taux de croissance des cellules individuelles ont été moyennés pour chaque point de temps (Fig. S2) et regroupés en deux fenêtres de temps de 20 h. Au cours des 20 premières heures, les taux de croissance unicellulaire étaient significativement plus élevés lorsque le dégradeur a connu un environnement de co-culture (rouge) par rapport à une condition de mono-culture. L'analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour de l'effet aléatoire de l'expérience) a révélé des taux de croissance significativement plus élevés pour la condition de co-culture ; (N(Co-culture) = 956 ; N(Monoculture) = 956, différence de taux de croissance = 0,09, std.Error = 0,02, p « 0,001). Le taux de croissance dans cette phase était de 11,1 % (± 2,6 %, erreur standard SE) plus élevé pour la condition de co-culture. La croissance pendant la phase de croissance secondaire est significativement plus élevée en monoculture ; (N(Co-culture) = 956 ; N(Monoculture) = 956, différence de taux de croissance = 0,52, std.Error = 0,02, p « 0,001). Le taux de croissance dans cette phase était supérieur de 173,3 % (± 7,4 %, SE) pour la condition de monoculture. D Comparaison de la croissance cellulaire totale pour les deux conditions de culture par lots à deux moments. Pour chaque machine mère microfluidique, l'accumulation de biomasse a été calculée (voir Méthodes). Au cours de la phase de croissance primaire, les cellules dégradatrices n'ont montré aucune différence statistique dans l'accumulation de biomasse. L'analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) n'a révélé aucune différence statistiquement significative dans l'accumulation de biomasse entre la co-culture et la mono-culture après 20 h (N (co-culture) = 49 ; N (monoculture) = 51, différence de biomasse = 0,06, erreur std = 0,03, p = 0,06). Le dégradeur a accumulé 1,1 % (± 1,1 %, SE) de biomasse supplémentaire au cours des 20 premières heures en condition de monoculture. Après 40 h, une analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) a révélé une différence statistiquement significative dans l'accumulation de biomasse entre la monoculture et la coculture. (N(Co-culture) = 49 ; N(Monoculture) = 51, différence de biomasse = 0,22, std.Error = 0,04, p « 0,001). Le dégradeur avait accumulé 26,2 % (± 4,6 %, SE) de biomasse supplémentaire à la fin de l'expérience de 40 h en condition de monoculture.

Nos données révèlent un changement dans les interactions entre le dégradeur et le dégradeur sur des échelles de temps écologiques : au cours de la période de croissance, l'effet du dégradeur sur le dégradeur passe de positif à négatif. Initialement, l'alimentateur croisé facilite la croissance, éventuellement par l'élimination des inhibiteurs de croissance ou la production de métabolites favorisant la croissance, ce qui influence positivement la croissance du dégradeur. Aux stades ultérieurs, la présence de l'alimentateur croisé diminue la croissance du dégradeur, peut-être parce que les deux types d'organismes se disputent les sous-produits métaboliques. Nos données suggèrent que les cellules dégradatrices libèrent des sous-produits métaboliques dans le milieu pendant la croissance sur les polymères (première phase de croissance), une interprétation que nous testons et soutenons ci-dessous. Certains de ces sous-produits peuvent être consommés à la fois par les dégradeurs et les alimentateurs croisés, mais l'alimentateur croisé consomme constamment les sous-produits libérés et, par conséquent, les cellules de dégradeur ne présentent plus une deuxième phase de croissance lorsque les alimentateurs croisés sont présents. Ces résultats montrent que les interactions entre les membres de la communauté peuvent changer sur de courtes échelles de temps écologiques.

Nos découvertes selon lesquelles le dégradeur est capable d'afficher une deuxième phase de croissance en monoculture mais pas en co-culture avec le chargeur croisé, soulèvent la question de savoir quel métabolite, ou quels métabolites, sont principalement à l'origine de l'interaction métabolique entre le dégradeur et le chargeur croisé. Un mécanisme d'interaction courant dans les communautés microbiennes marines est la production et la consommation d'acétate [30]. Afin de tester si la production et la consommation d'acétate jouent un rôle dans les interactions entre le dégradeur et le cross-feeder dans notre système, nous avons mesuré les concentrations d'acétate de mono- et co-cultures au fil du temps. Tout d'abord, nous avons étudié si les niveaux d'acétate varient entre la mono- et la co-culture à différents moments. Nous avons constaté que les niveaux absolus d'acétate dans les médias augmentent d'abord dans l'expérience (Fig. 4A). Cela indique que la production d'acétate est un sous-produit métabolique de la dégradation initiale de la chitine. Les niveaux d'acétate changent au fil du temps dans les deux conditions de culture discontinue. En co-culture, les concentrations d'acétate atteignent des niveaux de pointe inférieurs et sont globalement plus faibles lorsqu'elles sont corrigées en fonction de la taille de la population (Fig. 4B). Ces découvertes montrent que le cross-feeder consomme constamment une fraction de l'acétate produit. Dans la monoculture du dégradeur, l'acétate s'accumule dans les phases précoces et diminue ultérieurement. Cela indique que, compte tenu de l'opportunité, le dégradeur consommera l'acétate précédemment libéré, ce qui conduit à la croissance secondaire. Deuxièmement, nous voulions vérifier si les deux types de cellules étaient capables d'utiliser l'acétate accumulé. Nous avons constaté que les deux membres de la communauté consommeront de l'acétate s'ils poussent sur des supports usés provenant d'un lot de mono ou de co-culture (Fig. 4C). Pris ensemble, nos résultats indiquent que pendant les phases initiales de la dégradation de la chitine, l'acétate est produit en tant que sous-produit métabolique. En monoculture, le dégradeur produit de l'acétate dans les premières phases de l'expérience tandis que la chitine est encore disponible et consomme de l'acétate lorsque la ressource primaire a été épuisée (Fig. S4). En co-culture, le cross-feeder consomme constamment une partie de l'acétate. Cela empêche une phase de croissance secondaire du dégradeur en condition de co-culture. Nos données montrent que l'acétate libéré par le dégradeur est une source importante de nutriments pour le cross-feeder ; cependant, d'autres métabolites pourraient également jouer un rôle dans l'interaction d'alimentation croisée et des travaux supplémentaires sont nécessaires pour découvrir toute l'étendue des interactions métaboliques. Bien que l'acétate soit un métabolite commun impliqué dans l'alimentation croisée métabolique, la pléthore de métabolites susceptibles d'être libérés par le dégradeur n'est pas caractérisée dans notre étude. Par conséquent, il est important de noter que les interactions métaboliques précises dans ce système ne sont pas connues.

Concentrations d'acétate mesurées dans des cultures discontinues à différents moments. A Les niveaux d'acétate pour la monoculture de dégradeur (rouge) et les co-cultures (jaune) dans les cultures discontinues changent avec le temps. La présence du cross-feeder conduit à des niveaux d'acétate globaux inférieurs. (Test t de Welch à deux échantillons ; N = 8 ; 12 h : moyenne de la monoculture = 1,29 UF, moyenne de la coculture 1,09 UF ; t = 1,50, valeur p = 0,09, 24 h : moyenne de la monoculture = 2,95 UF, moyenne de la coculture 1,93 UF ; t = 2,17, valeur p = 0,02, 36 h : moyenne de mono-culture = 2,95 UF, moyenne de co-culture 2,28 UF ; t = 2,23, valeur p = 0,02, 48 h : moyenne de mono-culture = 2,31 UF, moyenne de co-culture 2,00 UF ; t = 1,27, valeur p = 0,11). Les niveaux d'acétate B par DO pour la monoculture de dégradeur (rouge) et les co-cultures (jaune) dans les cultures discontinues changent avec le temps. Dans les premières phases, la concentration relative d'acétate par DO est plus élevée. (Test t de Welch à deux échantillons ; N = 8 ; 12 h : moyenne de la monoculture = 9,39 UF, moyenne de la coculture 6,94 UF ; t = 2,14, valeur p = 0,03, 24 h : moyenne de la monoculture = 7,43 UF, moyenne de la coculture 4,11 UF ; t = 4,22, valeur p « 1e−3, 36 h : moyenne de mono-culture = 4,96 UF, moyenne de co-culture 2,15 UF ; t = 3,42, valeur p = 0,005, 48 h : moyenne de mono-culture = 2,58 UF, moyenne de co-culture 1,61 UF ; t = 2,38, valeur p = 0,02). C Les cellules degrader et cross-feeder peuvent consommer l'acétate disponible. Lorsque le dégradeur et le cross-feeder sont cultivés sur des milieux usés provenant de cultures discontinues, les niveaux d'acétate avant la croissance (rouge) et après 48 h de croissance (vert) varient. (Test t de Welch à deux échantillons ; N = 4 ; cross-feeder en mono-culture : moyenne de l'acétate au début = 2,79 UF, moyenne de l'acétate à la fin 0,91 UF ; t = 5,69, valeur p = 0,005 ; cross-feeder en co-culture : moyenne de l'acétate au début = 2,22 UF, moyenne de l'acétate à la fin 0,89 UF ; t = 6,50, valeur p = 0. 004 ; dégradeur en mono-culture : moyenne de l'acétate au début = 3,11 UF, moyenne de l'acétate à la fin 2,15 UF ; t = 2,61, valeur p = 0,02 ; dégradeur en co-culture : moyenne de l'acétate au début = 2,35 UF, moyenne de l'acétate à la fin 0,89 UF ; t = 5,12, valeur p = 0,007).

Dans les systèmes microbiens qui dépendent de la dégradation des polymères pour la disponibilité des nutriments, la croissance et la production d'enzymes sont étroitement couplées : les augmentations de la production et de l'activité enzymatiques augmentent la concentration des produits de dégradation assimilables et donc le potentiel de croissance. Étant donné que le taux de croissance du dégradeur est initialement augmenté en présence de l'alimentateur croisé (Fig. 3), nous avons recherché si les alimentateurs croisés augmentaient l'activité enzymatique totale dans les dégradeurs (soit par une augmentation de la quantité produite, soit par une augmentation de l'activité catalytique par molécule d'enzyme). A cette fin, nous avons mesuré l'activité enzymatique totale lorsque le dégradeur se développait seul et lorsqu'il se développait en présence du cross-feeder. En utilisant un kit de dosage enzymatique disponible dans le commerce, nous avons mesuré l'activité spécifique des chitinases dans les surnageants acellulaires. Nous avons constaté qu'en co-culture, l'activité de la chitinase est augmentée par rapport à une mono-culture dégradante (Fig. 5). Le chargeur croisé n'a pas d'enzymes qui clivent la chitine polymère (Fig. S1); au lieu de cela, nos données montrent que la présence de l'alimentateur croisé a augmenté l'activité enzymatique totale dans les cellules dégradatrices. Nous avons normalisé l'activité enzymatique en utilisant la DO totale de la communauté. Comme une partie de la communauté est constituée de cellules cross-feeder, nous sous-estimons donc l'activité chitinase par unité de biomasse dégradatrice.

Activité chitinase par unité DO (densité optique) en phase de croissance exponentielle dans un milieu minimal avec 0,1 % de chitopentose (p/v). La présence d'un alimentateur croisé augmente significativement l'activité globale de la chitinase de la communauté Le modèle à effet mixte (avec le type de culture à effet fixe et le jour de l'effet aléatoire de l'expérience) a révélé une activité significative de la chitinase pour la condition de co-culture ; N(Co-culture) = 8 ; N(Monoculture) = 8, différence d'activité chitinase = 1,0, std.Error = 0,36, p = 0,005). L'activité de la chitinase était supérieure de 241,2 % (± 85,7 %, SE) pour la condition de co-culture.

Une activité enzymatique plus élevée peut provenir de deux manières. Il est plausible que l'effet soit une conséquence de l'élimination des métabolites (c'est-à-dire par l'alimentation croisée) qui réduisent l'activité catalytique des enzymes elles-mêmes. En variante, d'autres effets tels qu'une augmentation de la production d'enzymes par le dégradeur sont également possibles. Nos données suggèrent donc que le cross-feeder est capable d'influencer la fonction au niveau communautaire de la dégradation de la chitine en augmentant l'activité enzymatique dans le dégradeur. Une activité accrue des enzymes lytiques entraînera généralement une augmentation de la disponibilité des produits de dégradation de la chitine et donc des taux de croissance plus élevés pour le dégradeur. Nous aborderons le mécanisme exact de ce phénomène dans une prochaine étude.

Nous avons observé que le cross-feeder augmente la croissance et l'activité chitinase des cellules dégradatrices. Cela soulève la question de savoir si les cross-feeders reçoivent un bénéfice indirect de cette interaction, à travers leur promotion de la croissance du dégradeur et l'augmentation résultante des sous-produits métaboliques. Ici, nous abordons cette question en mesurant la dynamique de croissance unicellulaire des cellules d'alimentation croisée alimentées en nutriments provenant de deux cultures de lots d'alimentation différentes. Une culture contenait une co-culture de dégradeur et d'alimentateur croisé (Fig. 2) tandis que la seconde culture contenait le dégradeur en mono-culture.

Dans la co-culture, l'alimenteur croisé se comporte comme dans une communauté naturelle où il peut interagir avec le dégradeur, par exemple en stimulant l'activité enzymatique. Lorsqu'il est connecté à une monoculture, l'alimentateur croisé fait l'expérience d'un environnement qui est purement façonné par le dégradeur. Les cellules individuelles d'alimentation croisée dans le dispositif microfluidique réagissent aux processus métaboliques de la population de dégradeurs dans la culture discontinue d'alimentation sans pouvoir les influencer. L'équivalent naturel de ce système serait une communauté où le cross-feeder est si rare que sa présence ne modifie pas le comportement du dégradeur tout en étant capable de consommer les sous-produits métaboliques excrétés. En utilisant cette approche, nous quantifions si le cross-feeder se développe mieux lorsqu'il est capable d'interagir avec le dégradeur et affecte l'environnement par sa présence.

Nous constatons que pendant les 20 premières heures, l'effet positif de l'alimentation croisée sur la dynamique de croissance du dégradeur ne se reflète pas dans l'augmentation du taux de croissance (Fig. 6A, C) ou de la production de biomasse de lui-même (Fig. 6B, D). Pendant ce temps, le chargeur croisé a affiché une augmentation d'environ 7 % du taux de croissance d'une seule cellule lorsqu'il est connecté à un lot de monoculture de dégradeur. Cela pourrait indiquer que les nutriments nécessaires à la croissance sont limités car les cellules nourricières consomment constamment les métabolites excrétés. À des moments ultérieurs, nous observons des taux de croissance unicellulaires élevés et une accumulation de biomasse pour les cellules nourricières croisées qui subissent une condition de monoculture dégradante (Fig. 6A – D). Pendant ce temps, l'alimentateur croisé a affiché une augmentation de 211% du taux de croissance d'une seule cellule lorsqu'il ne faisait pas partie de la culture d'alimentation. Cette différence de dynamique de croissance entre mono- et co-culture peut s'expliquer par la compétition intraspécifique. Lorsque le cross-feeder fait partie de la communauté, les cellules cross-feeder dans la culture d'alimentation consomment des métabolites et réduisent ainsi l'accès à ces métabolites pour le cross-feeder dans le dispositif microfluidique. Cela signifie que dans un environnement de co-culture, les nourrisseurs croisés font l'expérience d'une compétition intraspécifique. Cette compétition est absente dans un environnement de monoculture dégradant. Pris ensemble, nos données suggèrent donc que la présence de cross-feeders dans la communauté conduit à un épuisement rapide des sous-produits métaboliques et donc à une concurrence intraspécifique accrue.

Les cellules cross-feeder dans des puces microfluidiques ont été connectées à deux cultures discontinues différentes : une avec des cellules dégradantes en mono-culture (rouge) et une avec une co-culture de dégradeur et le cross-feeder (vert). A Les taux de croissance unicellulaire (points) sont tracés en fonction du temps. Les lignes représentent les moyennes lissées à l'aide d'un modèle additif généralisé. Initialement, les cellules d'alimentation croisée ont montré des trajectoires de croissance comparables pour les deux environnements. Au fur et à mesure que les cellules nourricières croisées dans la co-culture consomment les métabolites excrétés par le dégradeur, elles utilisent leurs ressources disponibles et les taux de croissance des cellules dans le dispositif microfluidique déclinent éventuellement. Dans l'environnement de monoculture du dégradeur, il n'y a pas de cellules qui consomment tous les sous-produits métaboliques précédemment libérés. Dans ces conditions, les cellules du dispositif microfluidique peuvent croître constamment car elles ne subissent pas de compétition pour les nutriments. Quatre expériences répétées ont été réalisées. Au total, 100 canaux de machine mère ont été analysés (N (co-culture) = 60 ; N (monoculture) = 40). Au total, 6558 cellules individuelles ont été analysées (N(Mono-culture) = 2657 ; N(Co-culture) = 3901). 322 (N(Mono-culture) = 48 ; N(Co-culture) = 274) points de données ne sont pas affichés car ils sortent de la plage de l'axe. B Accumulation de biomasse de cellules nourricières croisées dans un environnement de mono ou de co-culture. Au cours des 20 premières heures, les cellules dans les deux conditions accumulent la biomasse au même rythme. Pour les cellules d'alimentation croisée connaissant un environnement de co-culture, la biomasse commence à plafonner à la marque de 20 h. Les cellules individuelles connectées à un lot de monoculture dégradeur accumulent la biomasse à un taux constant jusqu'à la fin de l'expérience. C Comparaison du taux de croissance moyen des cellules cross-feeder entre les deux principales phases de croissance. Les taux de croissance des cellules individuelles ont été regroupés en deux fenêtres de temps de 20 h. Au cours des 20 premières heures, les taux de croissance des cellules individuelles étaient significativement plus élevés lorsque le chargeur croisé a connu un environnement de monoculture dégradant par rapport aux cellules qui ont connu un environnement de co-culture. L'analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) a révélé des taux de croissance significativement plus élevés pour la condition de monoculture ; (N(Co-culture) = 956 ; N(Monoculture) = 956, différence de taux de croissance = 0,04, std.Error = 0,01, p « 0,001). Le taux de croissance dans cette phase était supérieur de 6,8 % (± 1,2 %, SE) pour la condition de monoculture. Aux stades ultérieurs, la croissance au cours de la phase de croissance secondaire est significativement plus élevée pour les cellules connectées à une monoculture dégradante (le modèle à effet mixte (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) a révélé des taux de croissance significativement plus élevés pour la condition de co-culture ; N (co-culture) = 956 ; N (monoculture) = 956, différence de taux de croissance = 0,64, erreur std = 0,01, p << 0,001). Le taux de croissance dans cette phase était supérieur de 210,5 % (± 4,1 %, SE) pour la condition de monoculture. D Comparaison de la croissance cellulaire totale pour les deux conditions de culture par lots pour deux intervalles de temps. Pour chaque machine mère microfluidique, l'accumulation de biomasse a été calculée (voir Méthodes). L'analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) a révélé une différence statistiquement significative dans l'accumulation de biomasse entre la co-culture et la mono-culture après 20 h (N (co-culture) = 60 ; N (monoculture) = 40, différence de biomasse = 0,14, erreur standard = 0,06, p = 0,01). L'alimentateur croisé a accumulé 7,5 % (± 3,0 %, SE) de biomasse supplémentaire au cours des 20 premières heures en condition de monoculture. Au cours des étapes ultérieures, les cellules qui connaissent l'environnement de monoculture accumulent plus de biomasse. L'analyse à l'aide d'un modèle à effets mixtes (avec le type de culture à effet fixe et le jour à effet aléatoire de l'expérience) a révélé une différence statistiquement significative dans l'accumulation de biomasse entre la co-culture et la mono-culture après 20 h (N(Co-culture) = 60 ; N(Monoculture) = 40, différence de biomasse = 1,58, std.Error = 0,12, p « 0,01). L'alimentateur croisé a accumulé 59,7 % (± 4,5 %, SE) de biomasse en plus dans la condition de monoculture.

Des études antérieures ont montré que les taux de croissance cellulaire peuvent varier fortement entre les cellules individuelles d'une population [31]. Cette variation du taux de croissance peut être causée soit par une variation des micro-environnements des cellules [32], soit par des fluctuations stochastiques [33]. L'un des avantages de notre approche microfluidique est que nous pouvons mesurer directement cette variation des taux de croissance cellulaire et évaluer si et comment elle dépend des interactions interspécifiques.

Nous avons étudié si la variation des taux de croissance cellulaire et la distribution des taux de croissance cellulaire dépendent des interactions interspécifiques. Nous avons constaté que le dégradeur a généralement des distributions plus étroites que le cross-feeder (Fig. 7). Les distributions des taux de croissance des cellules dégradatrices ne varient pas beaucoup entre les conditions de croissance, mais elles changent avec le temps (Figs. S5 et S6). En revanche, pour l'alimentation croisée, nous avons observé un fort changement dans la forme de la distribution des taux de croissance entre les conditions de mono- et de co-culture à des moments ultérieurs (Fig. S5): dans des conditions de mono-culture, les taux de croissance à des moments ultérieurs montrent une distribution bimodale (Fig. 7) avec une sous-population à croissance rapide et une sous-population à croissance lente. Cela indique que si l'alimentation croisée est rare (imitée par la configuration de la monoculture), une partie de la population peut atteindre des taux de croissance élevés tard dans la saison de croissance ; probablement sur les sous-produits métaboliques qui se produisent encore à des concentrations substantielles. Une deuxième partie de la population semble ne pas croître ou croître plutôt lentement. Dans des conditions de co-culture, cette sous-population à croissance rapide n'est pas présente et les taux de croissance cellulaire globaux suivent une distribution plus étroite. Cette émergence d'une hétérogénéité phénotypique dans les taux de croissance entre des cellules génétiquement identiques plus tard dans le cycle de croissance est conforme aux observations précédentes sur la façon dont la limitation des nutriments peut favoriser les différences de croissance dans les populations clonales [32].

La variation des taux de croissance unicellulaire diffère pour le dégradeur et l'alimentateur croisé dans des conditions différentes. A Distributions de densité des taux de croissance unicellulaire pour le dégradeur en co-culture (jaune) et en mono-culture (rouge foncé) entre 34 et 36 h. Dégradeur sur Mono-culture : cv = 1,50, var = 0,004, Dégradeur sur Co-culture cv = 4,24 var = 0,003. Les calculs de bimodalité ne révèlent aucune croissance bimodale pour l'une ou l'autre des conditions. (Statistiques de trempage de Hartigan, co-culture : D = 0,003, p = 0,99, mono-culture : D = 0,003, p = 0,99). B Distributions de densité des taux de croissance unicellulaire de cross-feeder en co-culture (vert) et mono-culture (rouge clair) entre 34 et 36 h. Le coefficient de variation (cv) et la variance des distributions (var) montrent des différences nettes entre ces deux conditions. Cross-feeder sur Mono-culture : cv = 0,61 var = 0,018, cross-feeder sur Co-culture CV = 1,37 var = 0,005. Le calcul de la bimodalité à l'aide du test d'immersion de Hartigan montre une distribution bimodale claire pour l'alimentation croisée lors de la croissance sur une monoculture dégradante (D = 0, 02, p <0, 001) mais pas pour la croissance sur une co-culture ( D = 0, 004, p = 0, 75).

Nos mesures quantitatives unicellulaires de cellules dans un contexte communautaire nous permettent de poser des questions fondamentales en écologie des systèmes microbiens qui sont généralement difficiles à aborder expérimentalement. (1) Comment la dynamique de croissance d'une espèce est-elle affectée par la présence d'une autre espèce ? (2) Comment les interactions entre les espèces des communautés microbiennes évoluent-elles dans le temps ? (3) Les espèces bénéficient-elles des effets qu'elles ont sur les autres ?

Nous avons montré que les interactions changent au cours des périodes écologiques : au cours des premiers stades, les aliments croisés augmentent la croissance des dégradeurs - en augmentant l'activité catalytique des enzymes individuelles ou en induisant une augmentation de l'expression de la chitinase - tandis qu'aux stades ultérieurs, ils diminuent la croissance des dégradeurs - en les surpassant pour les sous-produits métaboliques, tels que l'acétate. Globalement, les cross-feeders ont donc eu un impact négatif sur la croissance des dégradeurs. De plus, nous avons montré que la croissance des cross-feeders est principalement affectée par la compétition intraspécifique pour les ressources.

Dans les écosystèmes naturels, les interactions métaboliques sont omniprésentes. Fréquemment, ils sont observés lorsque les cellules colonisent et dégradent des polymères naturels tels que la cellulose ou la chitine où des enzymes extracellulaires sont utilisées pour les digérer en sous-unités qui peuvent être absorbées dans la cellule [6]. Dans ces environnements, les espèces non lytiques se nourrissent de sous-produits métaboliques excrétés par les dégradeurs de polymères. Les communautés microbiennes qui colonisent ces particules polymériques suivent une dynamique de succession [5]. Divers microbes aux capacités métaboliques variables colonisent les particules marines à différents moments. Nous avons étudié l'alimentation croisée qui se produit dans de tels systèmes naturels en utilisant une petite communauté. Nous avons observé qu'outre les modèles de succession à long terme, les interactions qui changent sur de courtes échelles de temps influencent les propriétés au niveau communautaire dans ces consortiums. Dans des travaux futurs, notre système pourrait facilement être étendu à des communautés plus complexes. Par exemple, on pourrait étudier l'effet qu'une espèce focale a sur la dynamique de la communauté en utilisant des cultures par lots avec et sans cette espèce focale et quantifier la croissance de tous les membres de la communauté à l'aide du dispositif microfluidique (avec une espèce par canal). La microfluidique permet une parallélisation relativement simple et les communautés comptant jusqu'à ~ 6 à 8 membres pourraient potentiellement être étudiées à l'aide des outils actuels. De plus, il serait intéressant d'explorer la dépendance de la dynamique communautaire sur la fraction initiale des deux types de cellules.

Nos résultats soulèvent des questions importantes sur la nature prédominante des interactions microbiennes dans les environnements naturels. Dans la nature, les communautés microbiennes dégradant les polymères sont soumises à des facteurs chimio-physiques. La diffusion ou le flux local dans les écosystèmes marins pourrait empêcher l'accumulation de sous-produits métaboliques excrétés. Cela réduirait la capacité du dégradeur à consommer des métabolites précédemment libérés. Par conséquent, les interactions entre le dégradeur et l'alimentation croisée pourraient être davantage orientées vers une facilitation et une syntropie positives.

Ces résultats soulignent l'importance d'inclure la contribution des interactions interspécifiques en général et leur dynamique temporelle en particulier dans les modèles à l'échelle de l'écosystème. À terme, ces découvertes pourraient nous aider à concevoir des communautés microbiennes pertinentes pour notre bien-être et celui de nos écosystèmes.

Nous avons utilisé la souche de type sauvage Vibrio natriegens ATCC 14048 et Alteromonas macleodii sp. 4B03 (variant non agglutinant) isolé à partir de particules marines [8]. Les souches ont été cultivées dans un bouillon marin (MB, Difco 2216) et cultivées pendant une nuit à 25 ° C. Au total, 1 ml de culture cellulaire a été centrifugé (13 000 tr/min pendant 2 min) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Après élimination du surnageant, les cellules ont été lavées avec 1 ml de milieu minimum MBL sans source de carbone. Les cellules ont été à nouveau centrifugées et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de MBL (milieu minimal marin) [30, 34] ajusté à une DO600 de 0,002. Les cellules de ces cultures ont été utilisées pour des expériences dans du milieu minimal MBL contenant 0,1 % (poids/volume) de pentaacétyl-chitopentaose (Megazyme, Irlande). La source de carbone a été ajoutée au milieu minimum MBL et le filtre a été stérilisé à l'aide de filtres en acétate de cellulose sans tensioactif de 0, 22 μm (Corning, États-Unis). Un total de 500 µl des cultures préparées (250 µl + 250 µl pour les co-cultures) ont été ajoutés à 9,5 ml de MBL + 0,1 % de chitopentaose (v/w) dans des flacons de sérum. Il en est résulté une DO de départ de 0,0001. Les flacons comprenaient un agitateur et étaient scellés avec un joint en caoutchouc. Les flacons de sérum ont été stockés sur un agitateur magnétique de paillasse (500 tr/min) et connectés à la configuration microfluidique via des aiguilles Hamilton NDL NO HUB (ga21/135 mm/pst 2).

Des expériences de microfluidique ont été réalisées comme décrit précédemment [35,36,37,38]. La croissance cellulaire a été imagée dans les canaux de la machine mère de 25 × 1, 4 × 1, 26 μm (longueur × largeur × hauteur). Au sein de ces canaux, les cellules pouvaient découvrir le milieu de culture discontinu qui diffusait à travers les principaux canaux d'écoulement. Le dispositif microfluidique consistait en une cellule d'écoulement PDMS (50 µm/23 µm). La cellule d'écoulement PDMS a été fabriquée en mélangeant les produits chimiques du kit d'élastomère de silicone SYLGARD 184 10: 1 (p/v), en versant le mélange sur un agitateur principal et en le durcissant à 80 ° C pendant 1 h. La cellule d'écoulement PDMS solide a été découpée dans l'onde maîtresse et des trous ont été percés aux deux extrémités de chaque canal d'écoulement avant de la lier à un couvercle en verre (Ø 50 mm) en appliquant le réglage "élevé" pendant 30 s sur le PDC-32G Plasma Cleaner par Harrick Plasma. La cellule d'écoulement a été connectée via un tube Adtech PTFE de 40 mm (0,3 mm ID × 0,76 mm OD) à une pompe Ismatech 10 K avec 40 mm de tube Ismatech (ID 0,25 mm, OD 0,90 mm) qui était à nouveau connectée via un tube Adtech PTFE de 80 mm (0,3 mm ID × 0,76 mm OD) via un tube microbore Cole-Parmer Tygon court de 5 mm (EW -06418-03) (ID 0,762 mm OD 2,286 mm) connecteur à une aiguille Hamilton NDL NO HUB (ga21/135 mm/pst 2) qui a été insérée dans la culture d'alimentation. Pendant toute l'expérience, le débit de la pompe a été réglé à 1,67 ul/min (0,1 ml/h).

L'imagerie microscopique a été réalisée à l'aide de systèmes de microscope inversé Olympus IX81 ou IX83 entièrement automatisés (Olympus, Japon), équipés d'un objectif à contraste de phase × 100 NA1.3 à immersion dans l'huile, d'une caméra ORCA-flash 4.0 v2 sCMOS (Hamamatsu, Japon), d'un contrôleur de scène automatisé (Marzhauser Wetzlar, Allemagne), d'un obturateur et d'un système de mise au point automatique à base de laser (Olympus ZDC 1 et 2). Des informations détaillées sur la configuration de la microscopie ont été décrites par D'Souza et al. [39]. Les canaux sur la même puce PDMS ont été imagés en parallèle et des images à contraste de phase de chaque position ont été prises toutes les 5 minutes. Les unités de microscopie et la puce PDMS ont été maintenues à température ambiante. Toutes les expériences ont été réalisées à un débit de 0,1 ml h-1, ce qui garantit que les nutriments pénètrent dans la chambre par diffusion. Quatre répétitions biologiques ont été réalisées. Ces répliques sont constituées de quatre canaux microfluidiques indépendants (deux pour chacune des souches). Ces canaux ont été reliés à l'une des deux cultures discontinues indépendantes.

L'ensemble de données de microscopie se compose de 200 canaux de machine mère ; 49 canaux pour le dégradeur sur co-culture, 51 pour le dégradeur sur mono-culture, 40 pour le cross-feeder sur mono-culture et 60 pour le cross-feeder sur co-culture.

Le traitement des images a été effectué à l'aide d'une version modifiée du logiciel d'analyse d'images Vanellus (Daan Kiviet, https://github.com/daankiviet/vanellus), avec Ilastik [40] et des scripts Matlab personnalisés.

Les films ont été enregistrés pour compenser le mouvement de la scène et recadrés dans la région des canaux de croissance. Par la suite, une segmentation a été effectuée sur les images à contraste de phase à l'aide du flux de travail de classification de pixels supervisé d'Ilastik et le suivi des cellules a été effectué à l'aide de l'algorithme de suivi intégré Vanellus.

Après la curation visuelle de la segmentation et du suivi pour chaque machine mère et à chaque image, les paramètres de croissance ont été calculés à l'aide de scripts matlab écrits personnalisés [36]. Les longueurs des cellules individuelles ont été estimées en trouvant la ligne médiane de la cellule en ajustant un polynôme du troisième degré au masque cellulaire; puis la longueur de la cellule a été calculée comme la longueur de la ligne médiane entre les positions des pôles cellulaires automatiquement détectées (voir Kiviet et al. [33] pour plus de détails).

Nous avons quantifié la croissance cellulaire en calculant les taux d'élongation unicellulaire r à partir des trajectoires de longueur cellulaire mesurées : L(t) = L(0)∙e^(r ∙ t). Les longueurs et les taux de croissance des cellules variaient considérablement au cours du temps de l'expérience; nous avons ainsi développé une procédure robuste qui peut estimer de manière fiable les taux d'élongation à la fois pour les grandes cellules à croissance rapide ainsi que pour les petites cellules qui ne se développent pas. Nous avons d'abord log-transformé les longueurs de cellules, qui ont ensuite été lissées sur une fenêtre temporelle mobile d'une durée de 5 h (60 points dans le temps). Nous avons utilisé une régression locale de second ordre utilisant les moindres carrés linéaires pondérés (méthode rloess de la fonction lisse Matlab) afin de minimiser le bruit tout en maintenant la sensibilité aux changements de taux d'allongement. Par la suite, le taux d'allongement instantané a été estimé comme la pente d'une régression linéaire sur une fenêtre temporelle mobile de 30 min (7 points temporels). Les points temporels pour lesquels la qualité d'ajustement était mauvaise (χ2 > 10−4) ont été retirés de l'analyse [32]. Tous les paramètres ont été optimisés manuellement en inspectant visuellement la procédure d'ajustement de nombreuses trajectoires de longueur de cellule sélectionnées au hasard parmi tous les réplicats.

Comme les cellules sont continuellement perdues des canaux de la machine mère, il n'est pas trivial de calculer la quantité totale de biomasse produite dans la puce. Nous devons donc estimer cette quantité à partir des taux d'élongation observés pour les cellules individuelles. Plus précisément, nous avons estimé la quantité totale de biomasse produite par machine mère individuelle jusqu'à un moment donné comme :

Où est le taux de croissance moyen de toutes les cellules d'une réplique donnée au point de temps i, et où Δt est l'intervalle de temps entre deux points de temps. En utilisant le taux de croissance moyen, nous ignorons la variation des taux de croissance entre les cellules. Cependant, il est difficile de calculer la croissance de la population lorsque les taux de croissance varient à la fois avec le temps et entre les cellules et la méthode actuelle nous permet toujours de capturer l'effet global des interactions sur la croissance cellulaire.

Toutes les expériences de microfluidique ont été reproduites quatre fois. Aucune cellule n'a été exclue de l'analyse après curation visuelle. Pour V. natriegens, 2227 cellules ont été analysées en monoculture et 1707 cellules ont été analysées en coculture. Pour A. macleodii, 2657 cellules ont été analysées en monoculture et 3901 cellules ont été analysées en coculture. Chaque canal de la machine mère a été traité comme un échantillon indépendant. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans Rstudio v1.2.5033. Les augmentations en pourcentage ont été calculées en utilisant les différences relatives des estimations entre les valeurs correspondantes. Pour l'analyse des modèles à effets mixtes, le package LmerTest (version 3.1-3) [41] avec l'équation suivante a été utilisé : y ~ Batch + (1 | Replicate) Le test Tukey Post hoc a été réalisé à l'aide du package Multcomp (version 1.4-15) [42].

Les cellules degrader et Cross-feeder ont été cultivées dans un bouillon marin (MB, Difco 2216) et cultivées pendant une nuit à 25 ° C. Au total, 1 ml de culture cellulaire a été centrifugé (13 000 tr/min pendant 2 min) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Après élimination du surnageant, les cellules ont été lavées avec 1 ml de milieu minimum MBL sans source de carbone. Les cellules ont été à nouveau centrifugées et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de MBL ajusté à une DO600 de 0,002. Un total de 10 µl de culture cellulaire a été ajouté à 190 µl de MBL contenant 0,1 % de chitopentose (p/v). Les cultures ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle dans un lecteur de plaques (Eon, BioTek) à 25°C. Les surnageants acellulaires ont été générés par filtration stérile des cultures en utilisant une plaque de filtre multipuits (AcroPrep) dans une nouvelle plaque à 96 puits. L'activité de la chitinase des surnageants acellulaires a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage fluorométrique de la chitinase disponible dans le commerce (CS1030, Sigma-Aldrich) en suivant le protocole. En bref, 10 µl de surnageant stérile ont été ajoutés à 90 µl du mélange d'essai. La solution a été incubée dans l'obscurité à 25°C pendant 40 min avant de mesurer la fluorescence (Excitation 360 nm, Emission 450 nm) dans un lecteur de plaques (Synergy MX, Biotek). L'activité logarithmique de la chitinase par DO600 a été analysée pour huit répétitions.

L'activité de la chitinase en unités par ml a été calculée en utilisant une concentration standard. En utilisant la formule suivante : \({{{{\rm{Units}}}}}}/{{{{{\rm{ml}}}}}} = \frac{{\left( {{{{{{\rm{FLU}}}}}} - {{{{{\rm{FLUblank}}}}}}} \right) \times 1,9 \times 0,3 \times {{{{{\rm{DF}}}}}}}}{ {{{{{{\rm{FLUstandard}}}}}} \times {{{{{\rm{time}}}}}} \times {{{{{\rm{Venz}}}}}}}}\)

Ici, FLU indique la fluorescence mesurée, DF indique le facteur de dilution et V indique le volume de l'échantillon en ml [43].

Des cultures cellulaires ont été préparées et cultivées dans des flacons de sérum comme décrit ci-dessus. A différents intervalles de temps, 1 ml de culture a été prélevé et la DO6oo a été mesurée. Les cultures ont été stérilisées par filtration à l'aide de filtres en acétate de cellulose sans tensioactif de 0, 22 μm (Corning, États-Unis) dans un tube de microcentrifugeuse de 1, 5 ml. Les surnageants sans cellules ont été stockés à -4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient utilisés pour les mesures d'acétate. Les concentrations d'acétate ont été mesurées à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique (MAK086, Sigma-Aldrich) en suivant le protocole. En bref, 50 ul de surnageant acellulaire ont été ajoutés à 50 ul de mélange d'essai. La solution est incubée dans le noir à 25°C pendant 30 min. Les concentrations d'acétate ont été mesurées dans un lecteur de plaque (Eon, Biotek) à 450 nm [44].

Les cellules degrader et Cross-feeder ont été cultivées dans un bouillon marin (MB, Difco 2216) et cultivées pendant une nuit à 25 ° C. Au total, 1 ml de culture cellulaire a été centrifugé (13 000 tr/min pendant 2 min) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Après élimination du surnageant, les cellules ont été lavées avec 1 ml de milieu minimum MBL sans source de carbone. Les cellules ont été à nouveau centrifugées et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de MBL ajusté à une DO600 de 0,002. Un total de 10 ul de culture cellulaire a été ajouté aux 190 ul de surnageant acellulaire décrit ci-dessus. Les cultures ont été cultivées dans un lecteur de plaque (Eon, BioTek) à 25°C. Les surnageants exempts de cellules après ce test de croissance ont été générés par des cultures de filtration stériles en utilisant une plaque de filtre à plusieurs puits (AcroPrep) dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ces surnageants ont été utilisés comme décrit ci-dessus pour mesurer les niveaux d'acétate après croissance sur du milieu usé.

Tous les ensembles de données d'analyse d'images et les données sources des figures ont été téléchargés dans le référentiel de données Zenodo et seront mis à disposition lors de la publication. https://doi.org/10.5281/zenodo.6979866.

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Nous remercions Ben Roller et Mateus de Oliveira Negreiros pour leur aide dans l'analyse initiale des données. Alma Dal Co et Susan Schlegel pour avoir fourni des scripts pour l'analyse d'images ; Gabriele Micali, Guga Goram et Glen D'Souza pour des discussions et des conseils sur l'analyse des données ; Daan Kiviet pour la conception des dispositifs de croissance microfluidique ; Nous remercions également les membres de la Simons Foundation Collaboration on Principles of Microbial Ecosystems collaboration pour leurs commentaires sur le projet.

MD et MA ont été soutenus par la Simons Foundation Collaboration on Principles of Microbial Ecosystems (PriME #542389 et #542395), la subvention du Fonds national suisse de la recherche scientifique 31003A_169978 et par l'ETH Zurich et l'Eawag. SvV a été soutenu par la bourse Ambizione du Fonds national suisse pour la recherche scientifique PZ00P3_202186. Financement en libre accès fourni par l'Institut fédéral suisse de technologie de Zurich.

Département des sciences des systèmes environnementaux, Groupe d'écologie des systèmes microbiens, Institut de biogéochimie et de dynamique des polluants, ETH-Zurich, Zurich, Suisse

Michael Daniels et Martin Ackermann

Département de microbiologie environnementale, Eawag : Institut fédéral suisse des sciences aquatiques, Duebendorf, Suisse

Michael Daniels et Martin Ackermann

Programme interdisciplinaire de doctorat Biologie des systèmes, ETH-Zurich et Université de Zurich, Zurich, Suisse

Michel Daniels

Biozentrum, Université de Bâle, Bâle, Suisse

Simon van Vliet

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MD a conçu la recherche avec MA. MD a conçu et réalisé toutes les expériences. SvV a développé les algorithmes pour calculer la dynamique de croissance unicellulaire à partir du pipeline de segmentation cellulaire. MD a analysé les données avec les entrées de SvV et MA. MD a écrit le manuscrit avec des contributions de SvV et MA.

Correspondance avec Michael Daniels.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Daniels, M., van Vliet, S. & Ackermann, M. Les changements dans les interactions sur des échelles de temps écologiques influencent la dynamique de croissance unicellulaire dans une communauté microbienne marine à couplage métabolique. ISME J 17, 406–416 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-022-01312-w

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Reçu : 03 février 2022

Accepté : 23 août 2022

Publié: 07 janvier 2023

Date d'émission : Mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-022-01312-w

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