La plateforme de culture cellulaire microfluidique automatisée modulaire réduit le stress glycolytique dans les organoïdes du cortex cérébral

May 11, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 20173 (2022) Citer cet article

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Les systèmes d'organes sur puce combinent la microfluidique, la biologie cellulaire et l'ingénierie tissulaire pour cultiver des modèles in vitro 3D spécifiques à un organe qui récapitulent la biologie et la physiologie de leurs homologues in vivo. Ici, nous avons développé une plate-forme multiplex qui automatise la culture d'organoïdes individuels dans des microenvironnements isolés à des débits de médias définis par l'utilisateur. Les flux de travail programmables permettent l'utilisation de plusieurs réservoirs de réactifs qui peuvent être appliqués à la différenciation directe, à l'étude des variables temporelles et à la croissance des cultures à long terme. De nouvelles techniques de fabrication de puces en polydiméthylsiloxane (PDMS) sont décrites ici qui permettent des caractéristiques sur les plans supérieur et inférieur d'un seul substrat PDMS. L'analyse par séquençage d'ARN (ARN-seq) des cultures automatisées d'organoïdes du cortex cérébral montre des avantages dans la réduction du stress du réticulum glycolytique et endoplasmique par rapport aux cultures cellulaires in vitro conventionnelles.

La culture cellulaire a été un modèle principal pour l'étude de la maladie humaine et du développement depuis plus de 70 ans depuis l'isolement des cellules HeLa à partir d'une biopsie de cancer du col de l'utérus humain1,2. Utilisés à l'origine comme véhicule pour rechercher des virus, les protocoles de culture de cellules humaines ont été optimisés pour une croissance rapide et facile afin de produire de grandes quantités de matériel. Alors que les protocoles de culture tissulaire ont progressé, en particulier dans la réduction de nombreux composants de médias, une grande partie de ces recettes originales restent en place. Il reste encore beaucoup à faire pour que les protocoles de culture tissulaire imitent les concentrations, l'approvisionnement et l'élimination physiologiques des nutriments. La microfluidique automatisée nous permet d'aller au-delà des protocoles traditionnels en alimentant à des débits et avec une précision impossibles à réaliser manuellement.

Les progrès récents dans le domaine des cellules souches et de la biologie du développement ont généré des modèles plus précis ressemblant à des aspects du tissu humain primaire3,4. Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS), collectivement appelées cellules souches pluripotentes (PSC), ont le potentiel de se différencier en la plupart des types de cellules du corps, et les protocoles en ont profité pour générer des modèles de culture 3D pour les tissus humains, y compris le cerveau, l'intestin, le foie et le sein5,6. Ces cultures cellulaires auto-assemblées et spécifiques à un organe, appelées organoïdes, sont largement utilisées comme modèles in vitro dans la recherche sur le développement, la pathogenèse et la médecine7,8,9. Les organoïdes imitent les caractéristiques fonctionnelles clés de la physiologie de leur homologue tissulaire primaire avec plus de précision que les cultures cellulaires 2D6. Au-delà de leur utilisation en tant que modèles in vitro, les organoïdes sont également explorés pour des applications en médecine régénérative et en soins de santé en tant que tissus pour implants5. Alors que la technologie ouvre de nouvelles frontières, il existe un besoin croissant de meilleures méthodes pour cultiver, contrôler et analyser les cultures organoïdes. Il est nécessaire de réduire l'écart entre les cultures in vitro et le tissu primaire. Des efforts comme les avancées présentées ici tirent parti de la microfluidique de précision, de l'automatisation robotique et de la détection sans contact pour permettre une culture cellulaire robuste et reproductible optimisée pour la fidélité des tissus.

La capacité des organoïdes dérivés de PSC à s'auto-assembler et à générer de nombreux types de cellules spécifiques aux tissus les rend particulièrement utiles pour modéliser des tissus et des systèmes complexes. Le cerveau contient l'une des complexités les plus élevées du corps humain, et les chercheurs peuvent générer des modèles de haute qualité de différentes régions du cerveau grâce à la technologie organoïde. Les organoïdes cérébraux sont une forme d'organoïde cérébral qui modélise la physiologie du cortex cérébral, contenant de nombreux types de cellules et sous-régions spécifiques au cortex10. Ces organoïdes sont largement utilisés pour la recherche sur le développement cérébral prénatal11,12,13, les pathologies cérébrales14 et les tests thérapeutiques15. Les organoïdes cérébraux atteindront quelques millimètres de diamètre lors d'une culture prolongée et peuvent être maintenus en culture indéfiniment16.

La figure 1 illustre le processus de génération d'organoïdes cérébraux humains en agrégeant des PSC humains17,18. L'induction neurale est obtenue en inhibant les voies WNT (IWR1-\(\varepsilon\)) et Nodal/Activin (SB431542) et produit du tissu cortical dorsal et ventral. Comme le développement organoïde se déroule à un rythme similaire au développement fœtal primaire, ces cultures doivent être maintenues pendant des semaines à des mois pour observer les types de cellules et les structures tissulaires à un stade avancé. Celles-ci incluent des types de cellules différenciées en phase terminale telles que les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes, et l'observation de rosettes organisées localement composées de cellules souches neurales gliales radiales (Fig. 1B). Les protocoles actuels d'organoïdes cérébraux ont des limites de débit, de cohérence et de fiabilité, ainsi qu'une santé altérée, montrant des signes caractéristiques de stress cellulaire19,20. Le phénotype du stress cellulaire est probablement multifactoriel ; cependant, de nombreux facteurs peuvent résulter de la culture cellulaire traditionnelle. Le rythme des changements de milieux manuels (souvent une fois tous les 1 à 3 jours) entraîne des fluctuations erratiques de la disponibilité des nutriments et l'accumulation de métabolites toxiques. En se nourrissant à l'extérieur de l'incubateur, les cellules connaissent des températures plus froides et une réduction du dioxyde de carbone dissous, ce qui conduit à un environnement plus alcalin. L'automatisation des laboratoires est de plus en plus répandue dans les sciences de la vie pour réduire l'effet de ces variables incontrôlées et augmenter la quantité et la qualité des expériences permettant une maintenance facile à long terme avec des exigences manuelles minimales.

Vue d'ensemble du protocole de génération d'organoïdes cérébraux humains. (A) Les cellules souches pluripotentes humaines sont développées dans une culture 2D traditionnelle, dissociées, agrégées dans des micropuits et mûries dans des cultures organoïdes 3D en utilisant des conditions de médias définies pour favoriser la différenciation des tissus du cortex cérébral. Dans cette étude, au jour 12 après l'agrégation, les organoïdes ont été soit maintenus en suspension et maintenus manuellement (flèche noire), soit transférés dans des puits individuels d'une puce microfluidique et maintenus en automatisation (flèche bleue). (B) Images de cultures organoïdes cérébrales. Les images en champ clair à faible (gauche) et fort (centre) grossissement dans des conditions de culture standard montrent la morphologie et l'hétérogénéité des organoïdes. Taches d'immunofluorescence à la semaine 5 pour PAX6 (vert, cellules progénitrices de la glie radiale), CTIP2 (BCL11B) (magenta, neurones de projection excitateurs), ZO-1 (TJP1) (protéines de jonction serrées blanches sur les pieds gliaux radiaux, surface apicale du tube neural), montrent des structures de rosette caractéristiques en forme de zone ventriculaire avec de la glie radiale entourée de neurones. Noyaux colorés au DAPI (bleu). (C) Image de la puce microfluidique PDMS. La puce de culture cellulaire personnalisée, inspirée d'une plaque standard à 24 puits, abrite des organoïdes pour des expériences automatisées.

Dans la culture cellulaire conventionnelle, la distribution, le déplacement et l'élimination du liquide sont les actions nécessaires requises dans tous les protocoles. Par conséquent, la manipulation des liquides et le stockage approprié des réactifs liquides sont des caractéristiques clés pour automatiser ce processus. Les technologies actuelles de manipulation des liquides sont généralement classées en deux catégories : la microfluidique à flux continu et la microfluidique numérique21. Les systèmes à flux continu reposent sur un flux de liquide en régime permanent généré par des pompes à pression, mécaniques ou électrocinétiques. Avec un débit constant, ces systèmes offrent un contrôle élevé de la vitesse et de l'homogénéité ; cependant, ils sont moins flexibles pour les manipulations fluidiques complexes et difficiles à mettre à l'échelle. Les systèmes à canaux fermés dérivés d'un flux continu sont par nature difficiles d'accès, nécessitent une gestion des gaz piégés et ne s'adaptent pas bien car les paramètres qui régissent le flux à un seul endroit dépendent des propriétés de l'ensemble du système.

En revanche, la microfluidique à base de gouttelettes ou à flux segmenté contrôle des volumes discrets, ce qui est pratique pour la manipulation de gouttelettes22, le mélange, l'encapsulation, le tri, la détection et les expériences à haut débit23. En combinaison avec des vannes, la microfluidique à base de gouttelettes peut effectuer la plupart des opérations logiques sur les gouttelettes pour le tri, la fusion et la division. Le polydiméthylsiloxane (PDMS) est le matériau le plus courant pour fabriquer des dispositifs microfluidiques en raison de son faible coût, de sa polyvalence dans le prototypage et de sa perméabilité élevée aux gaz24. La microfluidique à base de gouttelettes a créé de nombreuses opportunités de contrôle qui sont soit impossibles, soit peu pratiques dans la pratique manuelle, telles que la programmation de la fréquence d'alimentation. Dans les deux technologies, il existe une variété d'approches avec et sans contact25. Les manipulateurs de liquides par contact nécessitent une pointe contenant du liquide pour rencontrer le substrat, similaire au pipetage mais avec une plus grande précision et un meilleur contrôle. Les manipulateurs de liquides sans contact manipulent les pressions et les vitesses des fluides pour contrôler le débit. Les deux technologies ont évolué vers des volumes ultra-bas (nano-litre) et des débits ultra-bas (micro-litre par heure).

Les organoïdes sont généralement cultivés par lots avec plusieurs organoïdes suspendus dans des puits uniques d'une plaque. Les conditions partagées dans un seul puits prennent en charge la cohérence des lots ; Cependant, en augmentant le nombre de variables dans une expérience, comme celle avec plusieurs génotypes, le débit devient difficile. De plus, les plaques multi-puits ne sont pas bien adaptées pour contrôler les conditions dynamiques ni générer des gradients de concentration dans les médias. En revanche, les puces microfluidiques en tant que chambres de culture organoïdes permettent un contrôle précis des conditions environnementales avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les dilutions en série peuvent atteindre des gradients automatisés et le flux volumétrique robotique peut gérer efficacement les expériences à haut débit. Le choix de l'appareil pour l'automatisation du laboratoire doit tenir compte de l'utilisation, de la flexibilité et du coût. Compte tenu du microenvironnement de la culture cellulaire, un système sans contact similaire à celui développé ici offre des avantages clés pour maintenir l'homéostasie des concentrations de nutriments, réduire l'accumulation de sous-produits métaboliques et générer des forces de cisaillement plus similaires aux conditions in vivo.

Ici, nous avons développé une plate-forme microfluidique sans contact basée sur PDMS avec une alimentation segmentée pour automatiser la culture cellulaire prolongée. La plate-forme est configurable pour de nombreux protocoles organoïdes et essais de gradient. L'interface de la plate-forme permet l'intégration avec d'autres instruments de recherche tels qu'un système d'imagerie en incubateur via l'Internet des objets. Nous avons évalué cette plate-forme en testant sa capacité à soutenir la croissance et le développement des organoïdes du cortex cérébral humain.

Nous avons développé une plateforme de culture cellulaire microfluidique automatisée pour optimiser la croissance des organoïdes 3D, la plateforme "Autoculture". Le système se compose de six modules liés (Fig. 2): (1) Réfrigérateur avec réservoirs de réactifs (par exemple, milieux frais), (2) Pompe à seringue, vannes de distribution et interface de contrôle, (3) réservoirs de collecte de médias conditionnés en chambre froide, (4) un bus série microfluidique interfaçant avec un incubateur de culture cellulaire, et (5) une puce organoïde microfluidique multiplexée qui (6) immobilise les organoïdes dans leur micro-environnement navire (1 de 24 puits). Pour alimenter les organoïdes, chaque puits individuel est desservi par un contrôleur fluidique ; le contrôleur élimine les médias usés par aspiration vers un collecteur dans un entrepôt frigorifique, puis réapprovisionne le récipient avec des médias frais à des intervalles programmables.

Chacun des 24 puits de ce système est une expérience séparée et isolée avec un tube d'entrée, un tube de sortie et un réservoir de collecte dédiés. Le programme d'alimentation de chaque puits est entièrement personnalisable en termes de débit et de milieu pour augmenter la flexibilité de l'expérimentation. Une plage de 5 à 1 000 \(\upmu \hbox {L}\) aliquotes provenant de 3 réservoirs de milieu/réactif peut être programmée pour n'importe quel puits. Les réservoirs de milieu/réactif peuvent également être utilisés en combinaison. De par leur conception, chaque puits forme un circuit fluidique qui maintient l'isolement des autres circuits de la plaque (voir "Méthodes"). Une plaque complète de 24 puits est entretenue en 72 secondes, et le temps entre les injections de fluide peut être n'importe quelle longueur au-delà (par exemple, toutes les heures, deux fois par jour, tous les deux jours, etc.). Les milieux conditionnés peuvent être récupérés pour l'analyse moléculaire sans perturber la culture à tout moment pendant ou après l'expérience. Les milieux conditionnés pris pour la collecte sont séparés des cultures par une phase d'air dans les canaux fluidiques de sortie pour atténuer le risque d'infection qui peut survenir à partir du milieu inactif dans les conduites. Après l'expérience, les organoïdes sont récupérés pour analyse moléculaire.

Conception et réalisation de la plateforme de culture microfluidique automatisée. (A) Illustration de la plate-forme de culture organoïde microfluidique automatisée, l'Autoculture. (B) Images de vue de face de l'Autoculture. (1) Réfrigérateur avec réservoirs de réactifs. (2) Pompe à seringue, vannes de distribution et interface de contrôle. (3) Réfrigérateur avec réservoirs de collecte de milieux conditionnés. Ces composants résident sur un banc de laboratoire directement au-dessus de l'incubateur de culture cellulaire. (4) Les tubes microfluidiques entrent par un port d'incubateur et se connectent à la puce de plaque de puits microfluidique (5) à l'intérieur de l'incubateur. (6) Schéma en coupe d'un seul puits contenant une culture organoïde.

Avec ces paramètres de contrôle, des plaques entières peuvent effectuer le même flux de travail pour générer des lots cohérents d'organoïdes. On peut également titrer un réactif avec un gradient incrémentiel de concentration du puits 1 à 24. De plus, on peut exécuter plusieurs protocoles/programmes d'alimentation sur la plaque et modifier les composants du support ou les programmes d'alimentation à différents moments tout au long d'une expérience.

L'Internet des objets (IoT) d'Amazon Web Services (AWS) fournit un cadre de contrôle pratique permettant à plusieurs appareils de communiquer des informations et d'initier des actions. Avec un protocole de communication tel que Message Queuing Telemetry Transport (MQTT), les systèmes peuvent gérer des efforts synchronisés et coordonnés de contrôle et d'acquisition de données en temps réel sur Internet28. La communication de système à système se produit sur un réseau local (LAN) tandis que les chercheurs peuvent effectuer des appels à la demande pour des données ou des actions à distance. En tant que telle, l'architecture logicielle d'Autoculture a le contrôle depuis le Cloud AWS pour concevoir, démarrer, mettre en pause, modifier et arrêter les expériences à la demande (Fig. 3).

Intégration IoT Cloud : une interface utilisateur graphique hébergée sur Internet relaie les messages à la plate-forme Autoculture via MQTT pour démarrer, surveiller et terminer les expériences.

Le module de calcul Raspberry Pi a été utilisé pour exécuter des expériences localement et accepter des commandes relayées via MQTT. L'interface de programme d'application (API) utilisée pour envoyer des commandes série à la pompe et aux vannes Tecan a été adaptée à partir d'un package Python open source29. Des protocoles pour réaliser des expériences ont été développés par des séquences chronométrées d'actions unitaires sur la pompe et les vannes. En tant qu'utilisateur, les paramètres et les plages disponibles pour construire des expériences automatisées sont répertoriés dans le tableau 1. Dans cette architecture, la connexion IoT offre l'accessibilité pour faire fonctionner des expériences à distance tandis que les horaires exploités localement sur l'appareil offrent la sécurité de fonctionnement en cas de connexion Internet instable.

La figure 4 décrit le processus de fabrication et d'assemblage de la puce microfluidique PDMS. La puce microfluidique verre-PDMS optiquement transparente a l'empreinte d'une plaque de 24 puits (85,5 mm × 127,6 mm) pour s'intégrer aux outils de laboratoire tels que les microscopes, les lecteurs de plaques et les distributeurs robotiques. Les 24 puits isolés sont adressables via des canaux carrés de 2 mm à l'interface verre-PDMS. Pour une accessibilité pratique, toutes les entrées sont situées dans une rangée sur le bord de la face de la puce et toutes les sorties sont situées dans une rangée sur le bord opposé. La conception microfluidique en boucle ouverte contient ici des puits ouverts à l'air. De cette façon, les bulles accumulées dans le système sont épuisées, il y a un échange de gaz libre avec l'environnement de l'incubateur et les organoïdes sont facilement accessibles pendant le chargement de la puce et la conclusion expérimentale. Chaque puits piège 120 \(\upmu \hbox {L}\) qui peuvent être utilisés comme micro-environnement, y compris l'utilisation d'échafaudages extracellulaires. L'entrée et la sortie des canaux fluidiques sont à 5 mm au-dessus du fond du puits, ce qui permet d'atténuer le risque de perdre un échantillon non adhérent dans le canal de sortie.

Fabrication de la puce microfluidique PDMS. (A) Rendu graphique du modèle de moule imbriqué pour le substrat PDMS dans l'assemblage de puce microfluidique. (B) Les montures imbriquées (bleu, rouge et vert) se fixent au moule de base (violet) et définissent des géométries microfluidiques sur le PDMS coulé qui sont conservées pendant que le substrat durcit. (C) Le substrat PDMS est retiré du moule et collé au verre. (D) Un rendu en coupe de la puce. Le fluide entre par des entrées microfluidiques sur la surface et suit des canaux scellés par du verre sur le fond vers des puits avec un accès ouvert par le haut. (E) Une plaque d'interface fluidique imprimée en 3D (jaune) relie 24 lignes de microtubes fluidiques aux entrées/sorties de la puce microfluidique. (F) Puce microfluidique (au centre) avec un exemple de la plaque d'interface fluidique (à gauche) et de la plaque d'interface fluidique entièrement installée (à droite).

Chaque plaque d'interface fluidique imprimée en 3D connecte simultanément 24 lignes (Fig. 4F). Il s'agit d'une simplification par rapport à l'insertion de chaque ligne individuellement, ce qui est courant pour les microfluides à base de PDMS. À l'intérieur des inserts de tube de la plaque d'interface fluidique, trois barbes circulaires scellent le tube Tygon à des saillies rigides. Les saillies rigides portant le tube s'alignent pour canaliser les trous d'accès de la puce microfluidique. Lorsque la collection de 24 lignes s'accouple avec les trous moulés dans le PDMS, les joints d'alésage se forment avec toutes les projections de la plaque et les lignes de tubes de la plate-forme sont alignées sur les canaux de la puce microfluidique.

Au jour 12 du développement, les cultures d'organoïdes cérébraux ont été transférées des agitateurs orbitaux (Fig. 5A) aux puits microfluidiques automatisés (Fig. 5B). L'agitateur orbital maintient un régime de vitesse quasi-stationnaire d'environ 0,12 m/s30,31,32. Nous avons effectué une simulation de dynamique des fluides computationnelle (CFD) à l'aide de Comsol Multiphysics33 (Fig. 5C) représentant les 2,2 premières secondes d'injection de média dans le puits. Le fluide entre par l'entrée, à 5 mm au-dessus du plancher de verre, et pénètre dans le puits par une paroi inclinée. La simulation commence par un domaine liquide de milieu rempli jusqu'au niveau des orifices d'entrée/sortie avec un domaine d'air existant au-dessus. Lors de l'alimentation, le média pénètre dans la cavité et génère une onde qui progresse de l'entrée à la sortie. L'organoïde, modélisé comme une sphère, fixée à 5 mm sous l'interface air-média, n'observe pas la plupart des turbulences générées. Le substrat inférieur (verre) subit \(<5\%\) de la vitesse maximale pendant l'alimentation. Les vitesses dans ce régime sont instantanées (par opposition à l'état quasi-stationnaire) et de deux ordres de grandeur inférieures à celles des agitateurs orbitaux, induisant des vitesses plus faibles et moins de contraintes de cisaillement sur la culture. L'un des avantages de ce système est que les chercheurs peuvent adapter le débit du support et le calendrier de livraison pour obtenir une diffusion optimale des nutriments avec une perturbation minimale de l'organoïde.

La dynamique des fluides computationnelle a simulé le flux dans les puits de culture tissulaire individuels à l'aide du système automatisé. (A) Les cultures organoïdes sont développées sur des plaques de puits tournées sur un agitateur orbital. (B) Après 12 jours, les organoïdes sont transplantés dans le puits microfluidique automatisé. (C) Un puits du système automatisé proposé avec injection de fluide constante sur 2 s avec des lignes de courant de vitesse.

La croissance des organoïdes cérébraux sur l'autoculture a été comparée à celle des conditions d'agitation orbitale dans une expérience de 18 jours. Des cellules souches pluripotentes humaines ont été agrégées pour former des organoïdes et maintenues dans des conditions standard pendant les 12 premiers jours au cours de l'induction neurale (voir "Méthodes"). Le lot a été divisé et 12 organoïdes ont été chargés sur une puce microfluidique Autoculture tandis que les autres ont été maintenus dans une plaque à 6 puits sur un agitateur orbital comme témoins. Chaque puits a été pré-chargé avec 50 \(\upmu \hbox {l}\) Matrigel immédiatement avant de charger les organoïdes pour faire adhérer chaque organoïde au centre du puits (voir "Méthodes"). Les organoïdes automatisés ont reçu 70 \(\upmu \hbox {L}\) toutes les heures pendant six jours, tandis que les témoins ont reçu 2 ml tous les deux jours. En automatisation, la plaque à puits n'a pas besoin d'être périodiquement retirée de l'incubateur pour l'alimentation ; par conséquent, ce système est bien adapté à la surveillance longitudinale du développement organoïde. Dans cette étude, les organoïdes de la plaque à puits Autoculture ont été surveillés une fois par heure à l'aide d'une plate-forme d'incubateur d'imagerie en champ clair34,35.

La figure 6A montre la plaque de culture microfluidique automatisée à l'intérieur d'un incubateur placé sur un système d'imagerie automatisé multi-puits télécommandé et compatible IoT. Le système d'imagerie a été conçu pour surveiller les expériences biologiques dans un format de plaque de 24 puits, en utilisant une caméra dédiée pour chaque puits. Pour tenir compte du développement tridimensionnel des organoïdes pendant toute l'expérience, nous avons capturé des rafales d'images, balayant la gamme de distances focales couvrant l'ensemble du tissu tridimensionnel. Un algorithme de vision par ordinateur a été utilisé pour détecter les caractéristiques au point à chaque plan focal, générer une image composite maximisant les caractéristiques au point dans l'ensemble de l'organoïde et calculer la zone projetée. Ce processus est décrit dans des travaux antérieurs35. La figure 6B montre 12 cultures d'organoïdes de cortex cérébral (jour 12), chargées dans des puits individuels de la puce microfluidique et alimentées en parallèle sur la plate-forme d'autoculture pour l'expérience. La figure 6C, D montre la croissance de "Culture 4" sur six jours successifs. Une croissance robuste des organoïdes a été observée pour les organoïdes dans les puits d'autoculture et était cohérente avec l'augmentation de taille observée pour les organoïdes cultivés dans des conditions de contrôle. Par rapport aux témoins, les organoïdes automatisés ont développé un périmètre moins dense, ce qui suggère que la réduction des vitesses et des forces de cisaillement peut s'adapter à la croissance et à la migration qui seraient autrement clivées.

Au jour 18, les cultures ont été récoltées et analysées par séquençage d'ARN en vrac (ARN-seq) et immunohistochimie pour évaluer les types de cellules générés dans chaque condition et la santé globale des cultures cellulaires. Les transcriptomes de 7 organoïdes "Automated" et 4 "Suspension" ont été comparés. L'expression génique des marqueurs de type cellulaire pour la neuralépithélie (SOX2), les cellules souches neurales de la glie radiale (SOX2, HES5, PAX6, HOPX), les progéniteurs intermédiaires (EOMES) et les neurones immatures (NeuroD1, RELN) n'a pas montré de différences cohérentes entre les échantillons d'autoculture et de contrôle, ce qui suggère que la fidélité globale de la différenciation n'a pas été affectée par l'utilisation du système d'autoculture (Fig. 7A). Conformément à cela, nous avons constaté une expression robuste des marqueurs protéiques progéniteurs neuraux, SOX2 et Nestin par immunohistochimie dans des sections d'organoïdes cultivés dans des conditions standard ou d'autoculture (Fig. 7B).

Suivi longitudinal du développement des organoïdes. (A) La puce microfluidique Autoculture repose sur un système d'imagerie automatisé à 24 puits télécommandé et compatible IoT. (B) Images en champ clair de douze cultures individuelles de cortex cérébral âgées de 12 jours au jour 1 de l'alimentation automatisée. (C) Imagerie longitudinale de "Culture 4" au cours de l'expérience. (D) Expansion de la zone projetée de "Culture 4" au cours de l'expérience. Ceci a été obtenu à l'aide d'un algorithme de vision par ordinateur34.

En comparant les organoïdes automatisés et témoins, nous avons observé une différence significative dans l'expression des gènes associés au stress de la culture cellulaire. Des études ont montré que les voies de glycolyse et de stress du réticulum endoplasmique (stress ER) sont régulées à la hausse dans les organoïdes par rapport aux échantillons de tissus in vivo, et celles-ci sont en corrélation avec la spécification et la maturation des sous-types cellulaires altérées17,19. Dans cette étude, la glycolyse canonique était la principale voie déférente, la grande majorité des gènes significatifs étant systématiquement régulés à la baisse (voir les tableaux supplémentaires 2 et 3). Les gènes qui sont particulièrement régulés à la hausse dans les organoïdes cérébraux ont montré des niveaux réduits dans la condition d'automatisation : ALDOA, ENO1, HK1 et PGK1 avaient des changements de pli de - 6,9, - 10,4, - 2,8 et - 9,3, respectivement (Fig. 7A). De plus, les marqueurs de stress ER : ARCN1, GORASP2 et YIPF1 ont été réduits par des changements de pli de -2,8, -2,2 et -3,0, respectivement. Voir le tableau supplémentaire 4 pour les gènes de stress ER exprimés de manière plus déférente.

Résultats de transcription et d'imagerie immunofluorescente. (A) Comparaisons par paires de l'expression de certains gènes associés à la différenciation neurale, à la glycolyse et au stress ER. Les résultats étaient statistiquement significatifs avec une valeur p ajustée ≤ 0,05, sauf pour HOPX et NES de différenciation neurale. Les données « automatisées » représentent 7 répliques biologiques et les données « Suspension » représentent 4 répliques biologiques avec 6 répliques techniques (B) Les taches immunofluorescentes pour SOX2, Nestin et DAPI de suspension et les sections organoïdes automatisées montrent des marqueurs progéniteurs congruents.

Les demandes croissantes d'expériences à long terme, de reproductibilité, de parallélisation et d'analyse longitudinale poussent la culture cellulaire vers l'automatisation. Cette étude présente une solution microfluidique automatisée pour la croissance et la maintenance d'organoïdes capables d'exister en conjonction avec d'autres dispositifs de contrôle et de détection sur l'Internet des objets, amplifiant la capacité de capitaliser sur la robotique de précision pour l'expérimentation automatisée. La combinaison de cette plate-forme avec la plate-forme d'imagerie illustrée ici (Fig. 6) fournit un environnement stationnaire qui permet de manière unique l'étude en direct d'organoïdes individuels au fil du temps. Cette plate-forme pourrait facilement être utilisée pour maintenir d'autres modèles organoïdes et tissus ex vivo. La puce microfluidique 24-plex décrite ici pourrait également être adaptée pour soutenir la croissance des cultures adhérentes (2D) en incluant une étape de protocole supplémentaire pour traiter la puce microfluidique avec un revêtement de surface d'adhérence cellulaire avant de charger les cellules.

L'utilisation d'agitateurs orbitaux pour la culture organoïde à long terme a été largement adoptée sur le terrain et offre des avantages pour la diffusion des nutriments et l'homogénéité des gaz dissous. Cependant, les vitesses de fluide et les forces de cisaillement présentes ne ressemblent pas à l'environnement embryonnaire. La microfluidique, comme dans le système présenté ici, pourrait être utilisée pour ajuster les vitesses des fluides, les forces de cisaillement et les gradients de pression tout en offrant les mêmes avantages à la concentration des nutriments et des gaz dissous grâce à des régimes d'alimentation rapides. Notre système permet un environnement de faibles vitesses. La simulation CFD présentée ici (Fig. 5) représente les conditions présentes dans l'expérience de validation qui ont préférentiellement sélectionné les faibles vitesses ; cependant, des taux de profusion plus élevés donneraient des gradients de vitesse plus élevés qui pourraient être utilisés pour étudier les effets sur la morphologie et la différenciation des organoïdes.

La réduction des niveaux de stress dans les modèles organoïdes cérébraux est cruciale pour atteindre la pertinence physiologique. Tel que mesuré par l'expression réduite de l'enzyme glycolytique, l'environnement de la plate-forme d'autoculture se traduit par des organoïdes à stress réduit par rapport aux conditions de culture en suspension traditionnelles. Les voies qui répondent aux conditions environnementales telles que le métabolisme du sucre, la surveillance de l'hypoxie et la production de protéines sont interconnectées par la voie intégrée de réponse au stress. En réduisant les fluctuations de concentration dans les milieux de culture cellulaire grâce à une alimentation automatisée, les cultures peuvent connaître une plus grande homéostasie. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour comprendre les effets potentiels à long terme de la réduction de l'expression génique des gènes de glycolyse et de stress ER et les conditions environnementales critiques qui sous-tendent la signature d'expression génique associée à moins de stress cellulaire que nous avons observé. Par exemple, on ne sait pas si l'épuisement des nutriments essentiels, comme le glucose, ou l'accumulation de métabolites cellulaires, comme le lactose, est le facteur critique conduisant à l'induction de gènes dans la voie de la glycolyse observée dans des conditions de culture organoïdes standard. Cependant, le système Autoculture que nous avons développé ici fournit une plate-forme dans laquelle nous pouvons systématiquement explorer cette question.

Le milieu de culture cellulaire a été stocké dans des réservoirs de bouteilles en verre (Corning) avec un bouchon de distribution de solvant multi-port (Spex VapLock) et stocké à \ (4 ^ {\ circ} \ hbox {C} \) pendant la durée de l'expérience. Chaque bouchon de livraison de réservoir contenait un seul tube microbore Tygon de 0,030″ ID × 0,090″ OD (Masterflex), scellé par un écrou en PTFE en deux parties et un adaptateur fileté de virole (Spex VapLock), s'étendant du fond du réservoir à un port d'entrée sur la tête de valve en céramique à 6 ports de la pompe à seringue (Tecan Cavro Centris, flacon en verre de 1,0 ml). L'air stérile est autorisé à remplir le réservoir à travers un filtre 0,22-\(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) fixé au capuchon pour compenser les tirages de réactif de la pompe à seringue. Le même tube microbore Tygon et les adaptateurs filetés à écrou et virole en PTFE ont été utilisés pour connecter la pompe à seringue à deux vannes de distribution parallèles à 12 ports (Tecan SmartValve). Chaque tube microbore Tygon de 0,020″ ID × 0,060″ OD (Masterflex) émanant de la vanne de distribution se connecte à un seul puits de la puce microfluidique. L'isolation fluidique entre puits est conservée à partir de cette jonction. Chaque vanne de distribution à 12 ports dessert six puits sur la puce microfluidique. Des systèmes à deux et quatre vannes de distribution ont été construits. La collection de tubes microbore de 2 m de long a été regroupée dans une tresse pour une manipulation pratique et guidée à travers le port d'entrée arrière d'un incubateur de culture cellulaire standard (Panasonic) (Fig. 2 (4)). Dans les conditions de l'incubateur (\(37^{\circ }\hbox {C}\), 5 % de CO2, 95 % d'humidité rel.), une seule plaque d'interface fluidique personnalisée imprimée en 3D accouplait l'ensemble de tubes microbore pour la distribution de réactifs aux entrées de la puce microfluidique et une seconde plaque d'interface identique accouplait l'ensemble de tubes microbore pour l'aspiration des réactifs aux sorties.

Les tubes microbore pour l'aspiration ont été guidés hors de l'incubateur et vers un ensemble de tubes coniques à usage unique de 15 ml (Falcon) pour la collecte de milieu conditionné (Fig. 2 (3)). Chaque réservoir de collecte était coiffé d'un bouchon en caoutchouc (McMaster) contenant deux trous percés de 0,06". Pour chaque bouchon, le tube microbore approvisionnant le milieu conditionné de la puce microfluidique a été inséré dans un trou, et un tube microbore sec pour les routes de fonctionnement pneumatique vers la tête de valve de distribution d'aspiration a été inséré dans l'autre trou. La pompe à seringue a été utilisée pour générer une pression négative sur chaque réservoir de collecte en série pour aspirer le milieu conditionné de la puce microfluidique dans le réservoir de collecte. Le tube de milieu conditionné a emprisonné l'afflux de milieu dans le réservoir de collecte.Tous les tubes de microbore ont été scellés hermétiquement à la valve de distribution et à la pompe à seringue avec des adaptateurs filetés à écrou et virole en PTFE.

La pompe à seringue et les vannes de distribution ont été connectées à l'aide de la configuration de câblage électrique multi-pompe décrite dans le manuel Tecan. Un module de calcul (Raspberry Pi 4) a relayé les communications série avec le protocole de communication Tecan OEM à l'aide d'une carte d'extension série GPIO TX/RX vers DB9M RS232 pour Raspberry Pi (Ableconn). Le module de calcul Raspberry Pi utilisait un écran tactile de 7 pouces pour éditer et lancer des protocoles. Une interface de programme d'application (API) Python open source a été utilisée pour développer le logiciel nécessaire à l'exécution de protocoles dans l'automatisation29.

La microfluidique à base de PDMS a été construite à l'aide d'un moule en plastique imbriqué en 3D (Fig. 4). Ceux-ci ont été imprimés avec une imprimante SLA (Formlabs Form 3) avec de la résine modèle V2. Les moules imprimés ont été post-traités avec sonication dans l'isopropanol (IPA) pendant 20 min pour éliminer l'excès de résine, suivi d'un séchage dans N2. Les composants secs ont été durcis sous lumière UV (405 nm) pendant 30 min à \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Comme illustré sur la figure 3, les parties du moule ont été assemblées et remplies de PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) préparé en mélangeant un prépolymère PDMS et un agent de durcissement (10: 1 w/w). Après remplissage du moule, le PDMS a été dégazé dans une chambre à vide pendant 1 heure. Le moule rempli de PDMS est laissé durcir pendant 24 h à \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) avant le retrait du PDMS du moule.

Les substrats en verre borosilicaté (\(101,6\hbox {mm} \times 127,0\hbox {mm}\, McMaster-Carr) ont été nettoyés par sonication dans de l'acétone (10 min), puis de l'alcool isopropylique (10 min) et séchés avec N2. Le substrat en verre et la surface moulée en PDMS ont été activés avec un plasma d'oxygène à 50 W pendant 45 s. Le verre et le PDMS (Fig. 4C) ont été alignés à la main, pressés ensemble et cuits à \(100\,^{\circ }\hbox {C}\) sur une plaque chauffante pendant 30 min, formant un joint irréversible.

Une couche de 10 \(\upmu \hbox {m}\) de parylène-C (Specialty Coating Systems) a été déposée sur la puce microfluidique pour empêcher l'absorption de petites molécules par le PDMS. Deux gouttes de silane A-174 (Sigma-Aldrich) ont été chargées dans la chambre de dépôt pour favoriser l'adhérence.

La plaque d'interface fluidique (Fig. 4F) a été imprimée en 3D pour interfacer le tube microbore de 2,2 mm OD (Cole-Palmer) avec les caractéristiques d'entrée et de sortie du PDMS. Chaque géométrie de connecteur consistait en 24 extrusions cylindriques avec un diamètre extérieur de 2,7 mm et un alésage de 2,2 mm. Dans chaque alésage se trouvaient trois barbes de 0,2 mm de long pour saisir le tube microbore lorsqu'il était inséré. Ce composant a été imprimé avec une imprimante Formlabs SLA (Forme 2) avec une résine de guide chirurgical avec sonication dans de l'isopropanol (IPA) pendant 20 min pour éliminer l'excès de résine, suivi d'un séchage dans N2. Les composants secs ont ensuite été durcis sous lumière UV (405 nm) pendant 30 min à \(60\,^{\circ }\hbox {C}\). Pour assurer la biocompatibilité, la pièce a été revêtue de 5 \(\upmu \hbox {m}\) de parylène-C (Specialty Coating Systems). Deux gouttes de silane A-174 (Sigma-Aldrich) ont également été chargées dans la chambre de dépôt avec le dispositif pour favoriser l'adhésion.

La stérilisation de la pompe à seringue, des têtes de valve, des tubes, des plaques d'interface fluidique et des bouchons de tube de collecte a été effectuée conformément aux recommandations du fournisseur (Tecan). Un lavage de 10 minutes avec 70% d'éthanol provenant d'un réservoir en verre autoclavé a été poussé à travers la plate-forme vers les réservoirs de collecte via la pompe à seringue. Après 70 % d'éthanol, un cycle de séchage d'air stérile provenant d'un filtre 0,22 \(\upmu \hbox {m}\) (Millipore) a été appliqué pendant 10 minutes. Dix cycles successifs d'eau déminéralisée sans noyau et de séchage ont été effectués avec les mêmes paramètres. La puce microfluidique et les réservoirs de médias ont été autoclavés à \ (121 ^ {\ circ} \ hbox {C} \) pendant 45 min et séchés pendant 15 min immédiatement avant utilisation. Tous les composants ont été transférés via des sacs autoclavables scellés dans une enceinte de sécurité biologique en culture tissulaire pour le chargement des organoïdes et des médias. Le milieu pré-préparé et complété a été transféré dans chaque réservoir de milieu et bouché (VapLock), puis stocké au réfrigérateur pendant la durée de l'expérience.

La lignée de cellules souches embryonnaires humaines H9 (WiCell, authentifiée à la source) a été cultivée sur des boîtes de culture cellulaire recouvertes de vitronectine humaine recombinante (Thermo) dans du milieu StemFlex (Gibco). La sous-culture a été réalisée en incubant des plaques avec 0,5 mM d'EDTA pendant 5 min, puis remise en suspension dans du milieu de culture pour être transférée sur de nouvelles plaques revêtues.

Pour générer des organoïdes cérébraux, les cultures adhérentes ont été dissociées en cellules individuelles à l'aide du réactif de dissociation cellulaire Accutase (Gibco), puis agrégées dans des plaques AggreWell 800 24 puits (STEMCELL Technologies) à une densité de 3 000 000 de cellules par puits avec 2 ml de milieu AggreWell (STEMCELL Technologies) additionné d'inhibiteur de Rho Kinase (Y-27632, 10 \(\upmu \ hbox {M}\), Tocris, 1254) (jour 0). Le jour suivant (jour 1), 1 mL du milieu AggreWell a été remplacé manuellement par un milieu supplémenté contenant un inhibiteur de WNT (IWR1-\(\varepsilon\), 3 \(\upmu \hbox {M}\), Cayman Chemical, 13659, jours 1-10) et un inhibiteur Nodal/Activin (SB431542, Tocris, 1614, 5 \(\upmu \hbox {M}\), jours 1-1 0). Au jour 2, les agrégats ont été transférés sur un filtre de 37 \(\upmu \hbox {m}\) (STEMCELL Technologies) en aspirant soigneusement avec une pipette à large alésage p1000 hors de la plaque AggreWell. Les organoïdes ont été transférés dans des plaques à 6 puits à ultra-faible adhérence (Corning) par inversion et rinçage des filtres avec du milieu AggreWell frais. Le support a été changé les jours 3, 4, 5, 6, 8 et 10 en remplaçant manuellement 2 ml de support conditionné par du support frais. Au jour 11 et au-delà, le milieu a été remplacé par du milieu de différenciation neuronale contenant du milieu Eagle : mélange de nutriments F-12 avec supplément GlutaMAX (DMEM/F12, Thermo Fisher Scientific, 10565018), 1X N-2 Supplement (Thermo Fisher Scientific, 17502048), 1X Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific, 11905031) et 100 U/mL Peni cillin/streptomycine additionnée de 0,1 % de facteur de croissance des fibroblastes humain recombinant b (Alamone F-170) et de 0,1 % de facteur de croissance épidermique humain recombinant (R&D systems 236-EG).

Les organoïdes "Suspension" du groupe témoin sont restés en suspension dans des plaques à 6 puits et ont été maintenus avec des changements de milieu de 2 ml tous les deux jours pendant le reste de la culture. Les organoïdes "automatisés" du groupe expérimental ont été chargés sur la puce microfluidique et ont subi des changements de milieu de 70 \(\upmu \hbox {L}\) une fois par heure pendant le reste de la culture.

Au jour 12 de la différenciation organoïde cérébrale, la puce microfluidique a été préparée en pipetant 50 \(\upmu \hbox {L}\) de matrice réfrigérée (environ \(0\,^{\circ }\hbox {C}\)) Matrigel hESC Qualif Matrix (BD 354277) dans chaque puits. Immédiatement après Matrigel, des organoïdes cérébraux uniques ont été transférés via une pipette p1000 à large alésage avec 70 \(\upmu \hbox {L}\) de milieu conditionné natif dans chaque puits et positionnés au centre du puits pour l'imagerie. La puce a été recouverte d'un couvercle de plaque à 24 puits et incubée à \(37^{\circ }\hbox {C}\) pendant 15 minutes pour fixer le Matrigel. Chaque puits a été rempli avec 70 \(\upmu \hbox {L}\) supplémentaires de milieu frais et connecté à des plaques d'interface fluidique (Fig. 4F) acheminées dans l'incubateur via un port d'accès arrière. Les plaques d'interface fluidique ont été insérées sous pression dans la puce microfluidique à la main, et la puce a été positionnée sur la plate-forme d'imagerie (le cas échéant).

Le protocole Smart-seq236 a été utilisé pour générer des bibliothèques de séquençage d'ADNc pleine longueur à partir d'ARNm d'organoïdes entiers. En bref, des organoïdes entiers ont été lysés à l'aide d'un tampon de lyse pour rendre le lysat cellulaire contenant des ARNm polyadénylés qui ont été transcrits en inverse avec Superscript III (ThermoFisher Scientific) à l'aide d'une amorce oligoDT (/ 5Me-isodC / AAGCATGGTATTCAACGCAGA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN) et la commutation de modèle a été effectuée avec un oligo de commutation de modèle (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG rG). L'amorce oligoDT et les séquences oligo de commutation de matrice ont servi de sites d'amorce pour l'amplification d'ADNc en aval (AAGCATGGTATTCAACGCAGAGT). L'ADNc a été quantifié à l'aide d'un test fluorométrique à haute sensibilité d'ADN Qubit 3.0, et la qualité a été évaluée à l'aide d'un kit de bioanalyseur d'ADN à haute sensibilité (Agilent). La transposase Nextera HT (Illumina) a été utilisée pour convertir 1 ng d'ADNc en bibliothèques de séquençage à code-barres.

Les lectures appariées ont été séquencées à 75 × 75 pb sur un Illumina NextSeq 550, et une profondeur supplémentaire a été séquencée à 50x50 pb sur un Illumina NovaSeq 6000 jusqu'à une profondeur de lecture moyenne de 65 millions de lectures appariées par échantillon. Les échantillons ont été démultiplexés à l'aide des codes-barres Illumina i5 et i7, et les échantillons de profondeur supérieure ont été sous-échantillonnés à 100M à l'aide de SAMtools37. Les lectures ajustées ont été combinées et alignées sur le génome humain (assemblage hg38 UCSC) avec l'alignement STAR38 (Gencode v37) à l'aide du pipeline toil-rnaseq39. Les paramètres STAR provenaient du pipeline DCC d'ENCODE40. L'expression différentielle des gènes a été réalisée à l'aide du package DESeq241 dans RStudio. L'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes a été réalisée à l'aide de g: Profiler42.

Les organoïdes cérébraux ont été collectés, fixés dans du paraformaldéhyde à 4% (ThermoFisher Scientific # 28908), lavés avec du PBS 1X et immergés dans une solution de saccharose à 30% (Millipore Sigma # S8501) dans du PBS jusqu'à saturation. Les échantillons ont été incorporés dans des cryomoules (Sakura - Tissue-Tek Cryomold) contenant un milieu de congélation tissulaire (General Data, TFM-C), congelés et stockés à − \(80\,^{\circ }\hbox {C}\). Les organoïdes ont été sectionnés avec un cryostat (Leica Biosystems #CM3050) à 18 \(\upmu \hbox {M}\) sur des lames de verre. Les sections d'organoïdes ont été lavées trois fois pendant 10 min dans du PBS 1X avant une incubation de deux heures dans 10% de BSA dans une solution de blocage de PBS (ThermoFisher Scientific #BP1605-100). Les sections ont ensuite été incubées dans des anticorps primaires dilués dans une solution de blocage pendant une nuit à \(4^{\circ }\hbox {C}\). Le lendemain, les sections ont été lavées trois fois avec du PBS 1X pendant 30 min. Ils ont ensuite été incubés dans une solution d'anticorps secondaires dilués dans une solution de blocage à température ambiante pendant 2 h. Les sections ont été lavées trois fois supplémentaires dans du PBS 1X pendant 30 min.

Les anticorps primaires utilisés étaient : lapin anti SOX2 (ab97959, dilution 1:250), poulet anti Nestin (ab134017, dilution 1:250) et DAPI (Sigma D9542-10mg). Les anticorps secondaires utilisés étaient : chèvre anti-lapin Alexa Fluor 594 (ab150080, dilution 1:250) et chèvre anti-poulet Alexa Fluor 488 (ab150169, dilution 1:250). L'imagerie a été réalisée à l'aide du microscope Zeiss Axioimager Z2 Widefield à l'Institut UC Santa Cruz pour la biologie des cellules souches (RRID:SCR_021135) et du logiciel Zen Pro. Les images ont été traitées à l'aide d'ImageJ.

La dynamique des fluides de remplissage et de vidange des puits a été prédite à l'aide d'un logiciel commercial Computational Fluid Dynamics COMSOL®Multiphysics 5.5 (Stockholm, Suède). La figure 5B montre les 2 premières s du cycle de remplissage (\(70\, {\upmu }\hbox {L}\) de média délivré avec une vitesse moyenne de \(9,85 \times 10^4\,\hbox {m/s}\)). Le puits a une profondeur de \(5\,\hbox {mm}\) et un diamètre de \(5,6\,\hbox {mm}\). Dans cette simulation, les propriétés du support étaient \(997\,\hbox {kg/m}^3\) densité et \(6,92 \times 10^3\,\hbox {kg/ms}\) viscosité. La simulation prédit la limite de phase (entre le liquide et l'air) comme une surface libre43. Le domaine de solution se compose d'une paroi rigide (le puits) avec des conditions aux limites "non glissantes" et de la surface supérieure (l'interface air-média) ouverte sur l'incubateur avec des conditions aux limites "glissantes". L'organoïde a été simulé comme une géométrie de sphère fantôme avec un diamètre de \(1,8\,\hbox {mm}\). Les conditions atmosphériques ont été fixées à une pression de \(1\,\hbox {atm}\), une température de \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) et une composition gazeuse de \(5\%\) dioxyde de carbone, \(17\%\) oxygène et \(78\%\) azote. Nous avons visualisé le champ de vitesse sur la section verticale centrale du puits à l'aide de lignes fléchées. La simulation a utilisé un total de 519 830 éléments tétraédriques.

Les données de séquençage de l'ARN polyadénylé ont été déposées dans GSE207894. Des données d'expression différentielle supplémentaires provenant de la Fig. 7A sont disponibles dans les tableaux supplémentaires 1 à 4.

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Ce travail a été soutenu par le Schmidt Futures SF 857 et le National Human Genome Research Institute sous le numéro de prix 1RM1HG011543 (DH, SRS et MT), l'Institut national de la santé mentale des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01MH120295 (SRS) Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA), Army Research Office, sous l'accord de coopération no W911NF-18-2-0104, et le ministère de l'Intérieur, prix N° D20AC00003. (MR et MT), la National Science Foundation sous le numéro de prix NSF 2034037 (REG, SRS et MT) et NSF 2134955 (MT, SRS et DH). DH est chercheur à l'Institut médical Howard Hughes. Les auteurs tiennent à remercier tout particulièrement Pattawong Pansodtee, David Parks, Matt Elliott pour les discussions et l'IBSC Cell Culture Facility (RRID:SCR 021353) et le UCSC Life Sciences Microscopy Center (RRID:SCR 021135) pour leurs précieuses ressources et leur assistance.

UC Santa Cruz Genomics Institute, Université de Californie Santa Cruz, Santa Cruz, Californie, 95064, États-Unis

Spencer T. Seiler, Gary L. Mantalas, Sebastian Torres-Montoya, Pierre V. Baudin, Victoria T. Ly, Liam Tran, Ryan N. Hoffman, Marco Rolandi, Richard E. Green, David Haussler, Sophie R. Salama & Mircea Teodorescu

Département de génie biomoléculaire, Université de Californie à Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, États-Unis

Spencer T. Seiler, Liam Tran, Richard E. Green et David Haussler

Département de biologie moléculaire, cellulaire et du développement, Université de Californie à Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, États-Unis

Gary L. Blankets, Ryan N. Hoffman et Sophie R. Salama

Département de génie électrique et informatique, Université de Californie à Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, États-Unis

John Selberg, Sergio Lamb, Sebastian Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Finn Amend, Marco Rolandi & Mircea Theodorescu

Institut médical Howard Hughes, Université de Californie, Santa Cruz, Santa Cruz, Californie, 95064, États-Unis

David Haussler

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STS, JS, SC et FA ont développé la plateforme de culture cellulaire microfluidique automatisée. GLM et RNH ont fourni des cultures cellulaires. STS et GLM ont réalisé les expériences et l'analyse du transcriptome. STM a développé la simulation de dynamique des fluides computationnelle PVB et VTL a effectué l'acquisition et l'analyse d'images. LT et RNH ont effectué une coloration immunohistochimique. STS a généré les photos et les dessins des figures. MR, DH, SRS, REG et MT ont supervisé l'équipe et obtenu le financement. Tous les auteurs ont contribué à la rédaction du manuscrit.

Correspondance à Sofie R. Salama ou Mircea Teodorescu.

STS et GLM sont les fondateurs d'OrganOmics, une société qui pourrait être affectée par les recherches rapportées dans le document ci-joint. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Seiler, ST, Mantalas, GL, Selberg, J. et al. La plateforme de culture cellulaire microfluidique automatisée modulaire réduit le stress glycolytique dans les organoïdes du cortex cérébral. Sci Rep 12, 20173 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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Reçu : 12 juillet 2022

Accepté : 08 septembre 2022

Publié: 23 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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Journal de la nanobiotechnologie (2023)

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